Framtida utveckling av biologiska dopingpass

Blodpasset (the Athlete Biological Passport, ABP) introducerades 2009 som ett komplement till de direkta dopingproverna, trots att man redan från början också insåg dess begränsningar. Passen visades verka också genom en avskräckande effekt, även om de matriser som används för longitudinell övervakning (urin och blod) är föremål för många inneboende (exempelvis genetiska) och yttre (exempelvis miljöförhållanden) ovidkommande påverkans-faktorer. I det sammanhanget bör då också påpekas att det föreligger en intressant utveckling av nya och mer specifika biomarkörer vilka kan öka både sensitivitet och specificitet för blodpasset. Flera strategier undersöks för närvarande för att förbättra denna longitudinella övervakning, med utvecklingen av de nuvarande modulerna, undersökningen av nya strategier eller screeningen av nya typer av dopning. Ett särskilt problem är att de indirekta biomarkörerna i allmänhet har en större variabilitet än de direkta metoderna och att samtidigt flera påverkansfaktorer – confounding factors – är sannolika. Utöver enorma framsteg inom analytisk känslighet verkar maskininlärningsbaserade – artificiell intelligens (AI) – tillvägagångssätt underlätta för en experttolkning av många biologiska profiler.

Även om detekteringstekniker har förbättrats avsevärt, är det korta detektionsfönstret för vissa ämnen fortfarande den största begränsningen för direkta dopingsbstansmätningar. Den första ABP-modulen som implementeras inkluderar hematologiska markörer som är känsliga för olika bloddopningsprotokoll, såsom olika typer av erytropoes-stimulerande medel (ESA) och autologa blodtransfusioner. En andra modul utvecklades för att hantera dopning av de så kallade ”pseudo-endogena steroiderna” (det vill säga endogena steroider när de administreras exogent), med en screening av urinbiomarkörer (varför ”Biologiska pass” är en bättre benämning än ”Blodpass”). Baserat på tidigare användande av ett Bayesiskt nätverk, är tröskelvärdena för varje idrottare individualiserade när mätpunkter registreras. Med mer än 180 överträdelser fram till 2022 av antidopningsregeln (ADRV) sedan dess implementering, visar ABP vara effektivt, åtminstone genom en avskräckande effekt.

De ovidkommande faktorerna som påverkar de nuvarande variablerna i ABP är fortfarande en av de viktigaste begränsningarna för den indirekta metoden. För den hematologiska modulen har inverkan av flera faktorer på plasmavolym (till exempel fysisk träning) och erytropoes (exempelvis höghöjdträning) identifierats. Vidare visades påverkan av exogena (till exempel alkohol) och endogena faktorer (exempelvis menstruationscykeln) ändra variabler i steroidmodulen.

Utveckling av nuvarande moduler

Variabler analyserade med flödescytometri (med Sysmex XN-instrumentgenerationen sedan 2019) används nu för mätning av ABP-hematologiska variabler. Med hjälp av en något modifierad teknik för mätning av retikulocyter jämfört med de tidigare XE- och XT-serierna, ger denna senaste generation av mätapparaterna kvantifieringen av många blodparametrar som för närvarande inte utnyttjas av ABP. Till exempel kan retikulocythemoglobinekvivalent (Ret-He) och omogen retikulocytfraktion (IRF) vara potentiella kandidater för utvecklingen av ABP-hematologiska modulen. Dessa senare variabler tycks vara mer känsliga för erytropoesförändring och oberoende av akut plasmavolymsförändringar. Betraktad som en potentiell markör för järnbrist, kan Ret-He dessutom bidra till det befintliga variablerna relaterade till järnmetabolism i ABP-ramverket. Dessutom har mikrovolumetriska kapillära helblodssamlingar nyligen föreslagits som ett alternativ till venös blodprovstagning. Insamlingsmetoden visar utmärkt överensstämmelse med den gamla metoden när man genererar individuella ABP-profiler och kan bli särskilt användbar vid provinsamling gjorda av personer utan medicinsk utbildning.

Forskning som försöker identifiera nya biomarkörer för att diskriminera dopningsmetoder är mycket intressanta. Dessutom är utvecklingen av markörer för att särskilja effekterna av de ovidkommnade påverkansfaktorerna ett ytterligare alternativ. Utöver detta har utvecklingen av korrigerade individuella gränser erhållits genom att kombinera flera markörer som är känsliga för plasmavolymvariationer (PV). En sådan modell har validerats ytterligare hos elitidrottare, vilket gjort det möjligt för dem att urskilja förändringar i hemoglobin-koncentrationen ([Hb]) orsakade av en förändring av erytropoesen från de som är ett resultat av en övergående hemodilution orsakad av fysisk träning eller höghöjdsexponering.

Giltigheten av dessa senare serumbiomarkörer vid bedömning av PV-variationer visades dessutom hos kvinnor som övervakades under två menstruationscykler. Modellen verkar därför särskilt lovande när det gäller att omfatta alla former av naturliga variationer i PV över tid och kan anses vara användbar i verktygslådan för tolkning av individuella ABP-profiler.

För att komplettera den nuvarande steroidmodulen utvecklas för närvarande utvecklingen av en “blodsteroidprofil.” Genom ultrahögpresterande vätskekromatografi-högupplösande masspektrometri (UHPLC-HRMS) har en metod för att kvantifiera flera endogena steroider i serum framför allt implementerats. Man har också gjort en longitudinell utvärdering av flera serumbiomarkörer efter administrering av transdermalt testosteron (T) hos kvinnor, där T/androstenedion-förhållandet visade en högre känslighet under behandling. Longitudinell övervakning har redan visat potentialen för serum-T-mätning med vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS) för att detektera T-dopning hos kvinnliga idrottare.

Testet med isotopmasspektrometri (IRMS) utförs för närvarande vid misstänkta variationer av en steroidprofil för att bekräfta steroidernas icke-endogena ursprung. Detektering av onormala isotopvärden i steroidprofil som inte identifierats som misstänkt av de nuvarande kriterierna för steroidmodulen i ABP, har dock longitudinell IRMS visat en bättre känslighet och en lägre individuell variabilitet i jämförelse med det traditionella tillvägagångssättet, baserat på koncentrationerna och koncentrationsförhållandena för steroidmarkörerna.

Eftersom bekräftelseproceduren vanligtvis är kostsam och tidskrävande, är det viktigt att en snabb IRMS-analys visat tillräcklig selektivitet. Longitudinell övervakning av 13C-värden för målsteroiderna och av de endogena referensföreningarna skulle till exempel kunna minska antalet falskt negativa resultat på grund av intaget av exogena pseudo-endogena steroider med en isotopsignatur nära de endogena. Att använda IRMS i en indirekt longitudinell screeningprocedur skulle dock representera en paradigmändring och nuvarande tröskelvärden kan resultera i en högre risk för falskt positiva tester ur statistisk synvinkel. Trots detta, även om denna paradigmförändring komplicerar dess implementering, kan tillämpningen av en IRMS-metod som ett extra screeningsverktyg genom utvecklingen av en “isotopmodul” vara ett särskilt lovande komplement till upptäckten av steroiddopning.

Utredning av nya antidopningsstrategier

I sökandet efter nya biomarkörer har omics-strategier också övervägts. Designad för att undersöka biomarkörer på cellnivå har tillvägagångssättet också föreslagits som analysmetod. Tidigare har transkriptomiska och proteomiska undersökningar visats vara av intresse men nyligen har även ett metabolomiskt tillvägagångssätt nyligen ett intressant perspektiv. I detta sammanhang identifierade exempelvis en nyligen genomförd studie en panel av metaboliter efter autolog blodtransfusion. Används även för screening av tillväxthormon och missbruk av testosteron, verkar individualiserade referensintervall vara det mest lovande tillvägagångssättet. Ändå utgör svårigheten att sätta referensvärden på grund av skillnader mellan idrottsgrenar eller olika ovidkommande störande faktorer som intensiv kardiovaskulär ansträngning och kosttillskott viktiga utmaningar för implementering på fältet. Därför, trots vissa begränsningar, bör ett explorativt metabolomiskt tillvägagångs-sätt som letar efter longitudinell profilering undersökas ytterligare.

Genom ett mikroskopi kan morfologin hos röda blodkroppar (RBC) också vara ett innovativt perspektiv i framtiden för bloddopningsdetektering, särskilt för blodtransfusion. Om de homologa blodtransfusionerna (HBT) är detekterbara med flödescytofluorimetri-baserad metod, är autologa blodtransfusioner för närvarande endast spårbara genom indirekta biomarkörer. Det är känt att vissa egenskaper hos RBC kommer att förändras under lagring, särskilt till membranmodifiering som inducerar en minskning av deformerbarheten. På detta sätt har förändringar i uttrycket av CD 55- och CD 59-yt-RBC-proteiner och variation i cellstorlek observerats, vilket visar relevansen av biomarkörer relaterade till blodets åldrande och lagring. Mer nyligen undersökte också i en studie cirkulerande RBC extracellulära vesiklar efter transfusion, vilket visade en ökning av denna biomarkör under timmarna efter reinfusion, vilket gav ytterligare bevis i händelse av misstänkt hematologisk profil. Därför kan ett morfologiskt tillvägagångssätt för RBC-membranförändringar komplettera ABP.

Screening av nya former av dopning

Longitudinella biomarkörer som är känsliga för andra typer av dopning kan också vara viktiga för utvecklingen av ABP. En endokrin modul som har utvecklats i mer än ett decennium av WADA kommer att introduceras för att inrikta sig mot användningen av tillväxthormon. Flera

biomarkörer har därför undersökts vid screening av olika tillväxthormoner (GH), särskilt prokollagen typ III N-terminal peptid (P-III-NP), insulintillväxtfaktor-I (IGF-I) och GH-2000 åldersdiskriminerande poäng till följd av dessa två biomarkörer. Stabiliteten hos dessa markörer bekräftar deras relevans i en longitudinell ansats, även om en stor intra-individuell variation verkar observeras hos kvinnor, vilket komplicerar den longitudinella uppföljningen. Mycket uppmuntrande resultat visas när markörerna tillämpas på ABP-modellen trots korta detektionsfönster. Ett liknande tillvägagångssätt tycks vara det enda alternativet för att även upptäcka dopning av andra tillväxtfaktorer, som för närvarande inte kan detekteras med andra analytiska tillvägagångssätt.

Tillämpning av artificiell intelligens

Tillämpningen av artificiell intelligens (AI) vid antidopning har undersökts i flera år. Genom att utveckla mjukvara som samlar in olika typer av information (till exempel fysisk prestation eller hematologiska data) utvecklades initialt en strategi för att förbättra måltestningen genom att betona onormala mönster. Sedan dess har flera maskininlärningsalgoritmer undersökts för att identifiera allmänna eller specifika dopningsmetoder undersökts. Efter ett liknande tillvägagångssätt av prestationsövervakning har föreslagits som ett alternativ till biologiska matriser. Med hjälp av prestationsdata som konkurrenskraftiga resultat eller på kritisk kraft, har ett “idrottarens prestationspass” föreslagits för att bygga individualiserade karriär-prestationsbanor. Dessa modeller bidra till att spåra onormala prestationer och slutföra biologiska undersökningar inom ett område där AI utan tvekan kommer att vara en del av framtida utveckling.

Slutsats

Utvecklingen av nya biomarkörer krävs för den senare utvecklingen av ABP. Flera undersökningsområden drivs för närvarande, där AI säkerligen kommer att spela en viktig roll. För en specifik och robust analys måste dessa nya markörer studeras omfattande för att bestämma den naturliga variationen, särskilt i en population av elitidrottare med många påverkande faktorer. Sammantaget skulle alla dessa resurser kunna ge ett steg framåt i måltestningen och stödja antidopningsmyndigheter att få rätt prov, vid rätt tidpunkt, från rätt idrottare.

Referens: Krumm B, Botrè F, Saugy JJ, Faiss R. Future opportunities for the Athlete Biological Passport. Front Sports Act Living 2022; 4: 986875.