Bestämning av erytropoietin i blod och urin

Röda blodkroppar (RBC) produceras i benmärgen genom stimulering av erytropoietin. Redan 1906 lade Paul Carnot och C. Deflandre fram bevis för att det måste finnas ett hormon som var ansvarigt för bildningen av röda blodkroppar (hematopoes) och gav den tänkta substansen namnet “Hematopoietin.”  1957 visade Leon O Jacobson, Eugene Goldwasser, Walter Fried och Louis F Plza att hematopoietinet producerades i njurarna och 1977 renade Takaji Miyake, Charles Kung och Eugene Goldwasser humant erytropoietin från myckt stora mängder urin från patienter med aplastisk anemi. 1983 klonades den humana erytropoietin-genen och 1989 godkände FDA det första läkemedlet med rekombinant humant erytropoietin för behandling av njurinsufficiensinducerad anemi.Erytropoietin produceras av levern fram till födseln. Efter födseln stimulerar hypoxi och anemi kraftigt, och renin-angiotensin-aldosteronsystemet (RAS) ökar erytropoietin-produktionen i njurarna något. Hormonella adjuvanser, inklusive androgener, aktiva vitamin D3-derivat och tillväxthormon, testades för att behandla njuranemi, men behandlingen har inte blivit populär på grund av begränsad effekt. Fram till användningen av erytropoesstimulerande medel (ESA) var blodtransfusion det huvudsakliga sättet att behandla patienter med njuranemi. ESA och Prolyl Hydroxylas Domain (PHD)-hämmare har i hög grad förändrat behandlingen av patienter med njurinducerad anemi. Stimuleringen av hypoxiinducerbar faktor (HIF) 2alfa och hämning av PHD2 orsakar en ökning av erytropoietinproduktionen i njurarna.Svårigheterna med att detektera erytropoietin genom Western blotting har förbättrats genom forskningsinsatser som delvis bekostats av WADA genom utveckling och  av detektions-metoderna.Utveckling av detektion av erytropoietinDetektion av erytropoietin genom Western blotting har varit svårt. Många rapporter under-sökte erytropoietin-mRNA-uttryck genom polymeraskedjereaktion (PCR) eller hybridisering in situ eller inkubationsmedium som substitut för erytropoietin. Innan den framgångsrika mätningen av erytropoietin med Western blotting, mättes erytropoietinnivåer i blod och urin med viss framgång med en enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) eller kemiluminescent enzymimmunanalys (CLEIA).Mätning av erytropoietinkoncentration i plasma utförs nu i stor utsträckning i klinisk miljö. Många antikroppar mot erytropoietin har framställt. Antikroppens specificitet har initialt kontrollerats genom biologisk aktivitet, främst med användning av radioisotoper. Rollen avglykosylering i den biologiska aktiviteten av erytropoietin har studerats omfattande. Gradvis avlägsnande av glukos från proteinet minskade efter hand den biologiska aktiviteten av erytropoietinin vivo, vilket tyder på betydelsen av glykosylering för den biologiskaaktiviteten av erytropoietin.För att detektera rekombinant erytropoietingenom natriumdodecylsulfatpolyakrylamid-gelelektrofores (SDS-PAGE) och Coomassie brilliant blue (CBB)-färgning i dessa studier krävdes en stor mängd rekombinant protein (några microg). Dessutom var mantvungnaatt rena proverna innan Western blotting.Isoelektrisk fokusering (IEF)-SIDADetekteringen av erytropoietin genom Western blotting har huvudsakligen utvecklats av WADA för att upptäcka illegal användning av ESA:er av idrottare. Urin var då vanligast använt. Det slående fyndet av användningen av IEF-PAGE var dock att endogent erytropoietin var surare än injicerat rekombinant erytropoietin, epoetin alfa och beta,epoetin-beta pegol (Continuous Erythropoietin Receptor Activator, CERA) och Epo-Fc (två mogna humana erytropoietinmolekyler kopplade till Fc-delen av humant IgG1).Dessutom visade sig NESP (New Erythropoiesis Stimulating Protein, darbepoetin alfa) vara mycketsurare än det endogena erytropoietinet.Natrium N-Lauroylsarcosinat (SAR)-PAGEWADA rekommenderade också en Western blotting-metod som använder SAR-PAGE för bättre differentiering av pegylerade erytropoietiner och ESAs. SDS-PAGE visar bättre differentiering av mindre ESA, såsom epoetin alfa, epoetin beta och Dynepo (epoetin delta). Känsligheten för SDS-PAGE för CERA minskar eftersom SDS binder till proteindelen av CERA och polyetylenglykol (PEG)-kedjan. Sarcosyl binder endast till proteindelen av CERA, och känsligheten är densamma med icke-PEGylerade epoetiner. SAR-PAGE-metoden används idag i antidopingsammanhang.Kapillärelektromigrationsmetoder

I denna metod kombineras i stället för SDS/SAR-PAGE ett kapillärelektroforessystemför Western blotting. Man har funnit att klonen AE7A5 är den bästa bland många monoklonala antikroppar. Denna kapillära Western blotting-metod är också en användbar metod för att detektera Epo-protein i både blod och urin.Vätskekromatografi/masspektrometri (LC/MS) analys

LC/MS-analys är ocksåett användbart verktyg för detektion av erytropoietin. Man kan använd LCMS-analys för att bekräfta att banden innehåller ertropoietin.

Deglykosyleringskopplad Western Blotting

Western blotting som rapporterats i många artiklar visar olika storlekar och former på banden. Den viktiga delen av WADA-rekommendationen är användningen av antikropps-klonen AE7A5. En annan viktig punkt är förrening av proverna. Förrening av proverna förbättrar kvaliteten på Western blotting. Det är dock inte lätt att utföra förrening avalla prover på grund av den höga kostnaden.Även om deglykosylering inte har blivit populärt, eftersom deglykosylering minskar den biologiska aktiviteten av erytropoietin, ökar det tillförlitligheten hos Western blot-resultaten.Metoder med deglykosylering-kopplad Western blotting

Serum och plasma kan användas som blodprov. Man använder vanligtvis 3–10 mikroL plasma eller serum. Eftersom urinkoncentrationen av erytropoietin är lägre än i blodet måste urinen koncentreras. Några ml urin räcker för att upptäcka erytropoietin om patienter har anemi.

Detektion av rekombinant erytropoietin och ESA

Humant och råttglykosylerad rekombinant erytropoietin visar ett brett band vid 28–47 kDa. Bandets bredd beror på mängden erytropoietin som laddas. Det deglykosylerade rekombinanta Epo-bandet är ett tunt band vid 22 kDa.ESA är större i storlek än endogent erytropoietin. Endogent erytropoietin i urindetekteras vid 35–38 kDa, och exogena ESA körs i en större storlek – epoetin alfa och beta vid 38–42 kDa, darbepoetin alfa vid 47–50 kDa och epoetin beta pegol (CERA) vid 93–110 kDa (CERA). Alla endogena eryropoietiner och exogena ESA förutom CERA skiftas till 22 kDa genom deglykosylering. Eftersom polyetylenglykol är bunden till CERA,,orsakar deglykosylering av CERA en liten förskjutning till 81–93 kDa.

Referens: Yasuoka Y, Izumi Y, Sands JM, Kawahara K, Nonoguchi H. Progress in the detection of erythropoietin in blood, urine, and tissue. Molecules 2023; 28: 4446.