Kommersiellt tillgänglig erytropoietin-gendoping

Gendopning har varit klassificerat som en förbjuden metod av WADA och International Olympic Committee (IOC) i över två årtionden. Trots att genterapeutiska metoder förbättras och samtidigt säkerhetsbekymren för kliniska tillämpningar minskar, fortsätter farhågorna om deras illegala användning inom elitidrott att växa. Två produkter tillgängliga via internet-baserade leverantörer och marknadsförda som innehållande erytropoietin och IGF1-gen analyserades för närvaron. I den aktuella undersökningen analyserades dessa två produkter från internetbaserade leverantörer för närvaron av potentiella gendopningsmedel med hjälp av en nyutvecklad multipel gen doping-testpanel. Två olika produkter (här benämnda EPO-P och IGF1-P), presenterade som nukleinsyrainnehållande formuleringar lämpliga för förbättring av idrottsprestationer, beställdes via en webbsida. EPO-P beskrevs som en plasmid som kodar för EPO-genen, medan IGF1-P skulle innehålla en plasmid med IGF1-genen. EPO-P beskrevs vidare som en syntetisk gen som, vid transkription, ger funktionell erytropoietin och ger lokala och systemiska effekter. CpG-motiv inom plasmiden skulle dessutom positivt stimulera kroppens immunsystem. Produkterna påstods vara “säkra” utan mutationseffekter på det mänskliga genomet. Båda produkterna avses injiceras intramusku-lärt med en koncentration av 0,04–2,85 mikrog/kg för IGF1-P eller 1 mikrog/kg för EPO-P var femte dag. IGF1-P påstods också vara lämplig för användning hos hästar.

Av detta skäl utvecklades en ny hög-multiplex gendopingpanel i samarbete med Agena Bioscience (San Diego, CA, USA) som möjliggör en multi-måldetektionsmetod med hjälp av matrix-assisterad tid-of-flight laser desorption/ionization (MALDI-TOF) masspektrometri (MS). Den nya metoden är baserad på en 20-plex PCR-amplifieringssteg och en efterföljande enbasförlängningsprocedur (SBE) med ett slutligt detektionssteg med användning av MALDI-TOF MS. Förlängningsprimrar för SBE-produktgenerering är placerade specifikt vid exon–exon-anslutningar hos relevanta transgena DNA-mål. Panelen omfattar primeranalyser för sju potentiella gendopingsmål (EPO, FST, GH1, MSTN (Propeptide), IGF1, VEGFA och VEGFD) med 2–3 detektionsanalyser per relevant måltranskript i en reaktion. För EPO-transgendetektion inkluderar panelen en detektionsanalys riktad mot exon(2)–exon(3)-anslutningen (EPO_1-analys) och en detektionsanalys mot exon(3)–exon(4)-anslutningen (EPO_2-analys). Eftersom flera protein-kodande transkript har rapporterats för den mänskliga IGF1-genen, ingår fyra analyser i panelen som täcker exon(3)–exon(4)-anslutningen (IGF1_1_1 och IGF1_1_2-analyser), exon(4)–exon(5)-anslutningen (IGF1_2-analys) och exon(4)–exon(6)-anslutningen (IGF1_3-analys).

Extrakt från båda produkterna visade sig innehålla transgen EPO-DNA, medan transgen DNA för IGF-1 inte detekterades. Resultaten bekräftades med SYBR Green qPCR med primer-set riktade mot EPO- och IGF1-cDNA samt CMV-promotorsekvensen.

Referens: Naumann N, Passreiter A, Thomas A, Krug O, Walpurgis K, Thevis M. Analysis of potential gene doping preparations for transgenic DNA in the context of sports drug testing programs. Int J Mol Sci 2023; 24: 15835.