DRIED BLOOD SPOT (DBS) 2.1

(Senast reviderad 2024-05-19)

DRIED BLOOD SPOTS (DBS)

”Blodprov på läskpapper”

Svenska Antidopingbiblioteket

Innehåll

Översikt över DBS i antidopingsammanhang

”Blodprov på läskpapper” är en inte ett nytt men nyintroducerat sätt att samla in blod för analys, exempelvis för dopinganalyser. Från början rörde det sig om en eller två droppar blod som samlades upp på ett läskpapper, men efterhand som metoden har utvecklats, bland annat genom ett specialutvalt papper och bättre analystekniker.

Genom att man numera även kan samla in urinprov på detta sätt – och gör så praktiskt – blir ju benämningen obsolet, både på svenska och på engelska. I avvaktan på en bättre benämning är det kanske klokast att kalla metodiken för DBS och strunta i att skriva ut vad förkortningen egentligen står för.

Dried Blood Spot testing (DBS), är en typ av biosampling där blodprover appliceras på filterpapper och torkas. Man har numera kunnat använda den också för urin och prov pågår med saliv, ledvätska, sädesvätska och dylikt. De torkade proverna kan enkelt skickas till ett analytiskt laboratorium och analyseras med olika metoder som DNA-förstärkning eller HPLC. Stabiliteten hos DNA, RNA eller protein kan tillskrivas det faktum att det biologiska materialet binder till matrisen av filterpapper och processen med torkning utesluter vatten, vilket är en viktig faktor som behövs för att proteaser eller nukleaser ska verka, och riskerar om vatten finns tillgängligt att i förtid bryta ner de substanser man avser att mäta. Bindningen av det biologiska materialet binder också flera hämmare som kan störa olika amplifikationsmetoder för nukleinsyror.

Ivar Bang beskrev först DBS som en ny provtagningsmetod redan 1913. Därefter rapporterade flera forskare om användningen av DBS för serologiska tester för att diagnostisera syfilis. Redan 1924 sammanfattade Chapman fördelarna med DBS-testning och betonade särskilt fyra punkter som fortfarande är relevanta idag:

jämfört med konventionell venpunktion krävs mindre blodvolym och detta kan vara särskilt viktigt inom pediatrisk diagnostik

blodinsamlingen är enkel, icke-invasiv och kostnadseffektiv

risken för bakteriell kontaminering eller hemolys är minimal

DBS kan bevaras under långa perioder med nästan ingen försämring av analyterna

Förutom användningen för att testa syfilis inkluderade tidiga tillämpningar av DBS-tekniken detektering av antikroppar mot mässling, påssjuka, poliovirus, parainfluensavirus och respiratoriskt syncytialvirus (RSV) år 1953, identifiering av Shigella i avföring torkad på filterpapper och skickad med vanlig post från Indonesien till Leiden i Nederländerna samt detektering av antikroppar mot Schistosoma i DBS tagna i endemiska områden exempelvis i Sudan och analyserade mer än tre månader senare

År 1963, femtio år efter Bangs ursprungliga meddelande publicerade Guthrie äntligen sin berömda metod för diagnos av fenylketonuri från DBS som erhållits genom en hälstick från nyfödda. Konceptet att kapillärt blod, erhållet genom att sticka i hälen eller fingret och applicera det på filterpapper, fick sitt största genombrott när man börja använda det för att screna efter metabola sjukdomar i stora neonatpopulationer och introducerades i Skottland av Robert Guthrie. Neonatalscreening för fenylketonuri (PKU) blev internationell 1969–70. Sedan dess har Guthrie-kortprover samlats in rutinmässigt från spädbarn i över 20 länder för att screena för fenylketonuri – det är en väl inarbetad och aldrig ifrågasatt rutin i Sverige – och mer nyligen också använd för exempelvis medfödd hypotyreos, sickle cell-sjukdomar och HIV-infektion. Även inom rättsmedicinen har DBS funnit användningsområden.

Sedan 2005 har en mängd nya och innovativa tillämpningar av DBS börjat utvecklas. Detta har resulterat i en nästan exponentiell ökning av antalet vetenskapliga publikationer om DBS från cirka 50 till nästan 450 årligen för närvarande. Bland de framväxande tillämpningarna finns mångsidiga områden som toxikokinetiska studier, metabol profilering, terapeutisk läkemedelsövervakning, rättsmedicinsk toxikologi och kontroll av miljöföroreningar.

Begränsningarna i känslighet och specificitet när man screenar så små blodvolymer (en droppe kapillärblod består av ungefär 50 mikroL) begränsade användningen av torkat blod under många år. På senare år har gjorts metodframsteg, som genom produktion av monoklonala antikroppar, produktion av syntetiska proteiner och introduktionen av polymeraskedjereaktionen, vilket övervunnit många av dessa problem. Den här typen av blodtest är nu tillgänglig för användning hemma av ”vanliga” konsumenter i exepelvis USA. Tillgängliga blodtester inkluderar vitamin D, östrogen, testosteron, kortisol, TSH och lipider (New York är den enda delstaten som förbjuder hemmabloodspot-testning).

Praktiskt samlas DBS-prover in genom att applicera några droppar blod, tagna med lansett från fingret, hälen eller tån, på särskilt tillverkat absorberande filterpapper. Blodet tillåts mätta papperet helt och lufttorkas i flera timmar. Det är viktigt att undvika att röra vid cirkelområdet där bloddroppen eller bloddropparna appliceras, särskilt innan blodet droppats och har torkat helt. Blodprovet kan även appliceras med en kalibrerad pipett på provtagningspappret för att undvika potentiella provtagningsfel. Det är mycket viktigt att blodfläckarna torkar helt innan förvaring eller transport. Generellt sett rekommenderas en minimitid på 2–3 timmar för torkning på en öppen plats i rumstemperatur. Torkningstiden beror dock på papperstypen och den applicerade blodvolymen.

Efter torkningen bör DBS-proverna skyddas mot fukt och fuktighet. Fuktindikatorer bör inkluderas i förvaringsförpackningen. DBS-prover som skyddas på detta sätt kan förvaras i rumstemperatur i många veckor, månader eller år, beroende på ämnets stabilitet. Prover som innehåller instabila ämnen bör dock förvaras vid lägre temperaturer för att öka stabiliteten. Proverna förvaras lämpligen i plastpåsar med låg gaspermeabilitet och fuktighetsreducerande medel tillsätts, och de kan sedan förvaras vid rumstemperatur, även i tropiska klimat. När de kommer till laboratoriet separerar tekniker en liten skiva av mättat papper från arket med hjälp av en automatiserad eller manuell hålpunch och släpper ner skivan i en plattbottenplatta. Blodet elueras ut i fosfatbuffrad saltlösning innehållande 0,05 procent Tween 80 och 0,005 procent natriumazid, över natten vid 4 °C. Resultatplattan med eluaten utgör “mastern” från vilken utspädningar kan göras för efterföljande tester. Som ett alternativ till att punktera ut en pappersskiva extraheras provet numera med automatiska lösningar genom att spola ett lösningsmedel genom filtret utan att punktera ut det. En automatisering inklusive tillämpning av en intern standard före extraktion har utvecklats av det schweiziska företaget CAMAG.

Med utvecklingen av polymeraskedjereaktionen (PCR), en teknik som underlättar snabb analys av DNA från små provvolymer genom DNA-förstärkning, är det nu exempelvis möjligt att få tillräckligt med DNA i DBS-prover från nyfödda för att identifiera mutationer. DNA finns i nukleära vita blodkroppar och det har uppskattats att en DBS-blodfläck på 1 mm innehåller i genomsnitt 9600 vita blodkroppar. DNA är en mycket stabil analyt och DBS-prover som har lagrats i 10 år, även under tropiska förhållanden med hög temperatur och luftfuktighet, har visat sig vara tillförlitliga för analys av genomiskt DNA.

DBS är attraktiva för biobanker på grund av deras låga kostnad och enkla användning och lagring. En studie visade att man enkelt kunde samla in stora mängder torkade blodprover från donatorerna. Det potentiella medicinska värdet av sådana biobanker är stort på grund av deras förmåga att detektera proteinnivåer och andra blodbiomarkörer. DBS är nu en integrerad del av dopingtestningen även om metoden ännu inte finns tillgänglig överallt.

De främsta principiella fördelarna med DBS ur antidopingsynpunkt är:

man behöver inte en sjuksköterska eller annan specifikt medicinskt utbildad att ta provet.

provtagningsprocessen är enkel eftersom torkade prover kan förvaras i rumstemperatur med en avfuktare i minst två veckor

mediet gör provet idealiskt för lagring och transport i rumstemperatur

ett DBS-kort kan användas för att testa både sjukdomar, virusspridning och exempelvis doping, men man behöver inte på förhand bestämma vad man senare vill analysera

testning blir mer tillgänglig för personer som bor på avlägsna platser och samhällen som saknar personer som kan ta venösa blodprov

Det finns emellertid också utmaningar med DBS-provtagning som kan påverka efterföljande analyser. Hematokriteffekten är den mest kända nackdelen med DBS. “Mjölkning” av punkteringsstället orsakar en ökning av interstitiell vätska i DBS och är den främsta orsaken till hematokriteffekten. Felaktig provinsamling, ålder och olika kliniska tillstånd kan påverka hematokriten, påverka viskositeten och påverka blodets spridbarhet på samlingskortet.

Provets heterogenitet förblir också en utmaning för DBS. Hematokrit, provvolym och felaktig applicering av blod på kortet kan leda till en ojämn fördelning av analyter i blodet, och till skillnad från konventionella kliniska prov är blandning inte ett alternativ för att uppnå en homogen provmatris. Prover utanför det fördefinierade målområdet kommer inte att behandlas med den utstansade skivan, vilket påverkar extraktionsåtervinning och analytmätning. Även om dessa utmaningar utgör ett betydande hinder för bred klinisk användning av DBS, är framväxande innovationer och teknologiska framsteg inriktade på att mildra dessa begränsningar.

För svenska förhållanden – också inom EU – är det viktigt att veta att det krävs ett individuellt godkännande av den person som lämnat blodprovet på DBS dels att det får sparas, dels att det få användas för andra ändamål än det var tänkt när provet lämnades.

Ur antidopingsynpunkt är tillgång till DBS en stor framgång och det är sannolikt att den största delen av dopingtestning i framtiden kommer att ske via DBS.

PRAKTISK UTVECKLING

Bloddroppar från överarmen istället för fingret

Teoretiskt är det mer tilltalande att mäta vad som försiggår i kroppen genom blodprovs-tagning än genom att undersöka urinprov – blodprov ger en ögonblicksbild medan urinproverna visar vad som händ under en period mellan två vattenkastningar och således dåligt speglar snabba skeenden (dessutom är urinprov beroende på njurarnas funktion). När det gäller dopingprov finns det dock en viss tveksamhet för att utsätta idrottsutövare – särskilt elitidrottare – för venösa blodprov då det alltid finns en liten, liten risk för komplikationer till blodprovstagningen, i första hand blödningar. Dessutom kräver venösa blodprover särskilt utbildad personal och speciella (kostsammare) rutiner för omhändertagandet.

I en studie från Danmark kunde man nu visa att det gick lika bra att göra ett litet stick i huden med en stilettliknande apparat i överarmen där det är mindre känsligt än i fingertoppen där många tycker att det är mer obehagligt och gör ont. Detta kan ses som ytterligare ett steg mot att ersätta många venösa blodprov på idrottsutövare med DBS när det gäller dopingtester.

Sparande av DBS-blodprov i samband med venös provtagning

Denna artikel är ytterligare en i raden som utvecklar Dried Blood Spot (DBS). Det finns flera fördelar med att göra dopingtester på detta sätt:

Kapillära prov, vilket innebär att personer som inte är medicinskt utbildade kan ta proverna och där handhavandet av provtagningen blir ytterst förenklat

Idrottsutövarna tycker inte om att ta venösa blodprov; om man inte vill bli stucken i fingrarna kan man sticka på överarm, örsnibb eller liknande

Metoden kan nu användas för analyser av ett mycket stort antal substanser och deras metaboliter – dessutom utvecklas nya metoder i god hastighet

Transporten av läskpappren blir enklare och billigare

Kölnlaboratoriet – Europas ledande antidopinglaboratorium ur vetenskaplig synvinkel – har nu gjort översikt av DBS och dess användningsområden. Det som särskilt aktualiserades var nu att man kan ta DBS samtidigt som man tar venösa blodprov. De venösa blodproven är mycket mer svårförvarade när det gäller långtidsförvaring varför det verkar fiffigt att vid exempelvis mästerskap förutom det venösa blodprovet som analyseras i samband med tävlingen droppa en eller några bloddroppar på läskpapper och sedan spara dessa. Om man sedan vill retesta något tar man fram läskpappret och klipper av en bit och testar utan att behöva tina upp, riskera förstörande av prover med mera. Detta ter sig som ett framtidssätt att spara dopingprov under lång tid.

Alternativ ny teknik för blodprovstagning lämplig för antidoping (”Tasso”)

Det är sannolikt att utvecklingen går från urinprovstagning till blodprovstagning vid dopingtestning, helt i analogi med hur man tar blodprov istället för urinprov i medicinsk verksamhet. En annan utvecklingslinje gäller att man använder modern mikroteknik för tester. Ett första steg i denna riktning är användning av DBS (dried blood spot) som kan karaktäriseras som att man droppar en bloddroppe på ett läskpapper som sedan får torke, vilket gör proceduren enkel att transportera och förvara.

Nu lanseras ytterligare en innovativ blodinsamlingsmetod lämplig att användas också av icke sjukvårdsutbildade. Det rör sig om en engångsprovstas som består av en liten sugkopp i plast som sättes exempelvis på överarmen där man brukar vaccinera sig. som är både effektiv och idrottsvänlig. Efter att ha värmt huden i 2 minuter sätter man på sugkoppen som ”stratas” genom ett tryck på den stora knapp som ger ett undertryck. Inom en femminutersperiod – oftast kortare tid – samlar den nålfria enheten upp cirka 500 mikroliter blod, vilket är sex gånger mindre än en standardblodtagning. Man frigör sedan det lilla röret i vilket helblodet (utan koagulantia) samlats upp, vilket stängs med en lite kork och läggs i ett större rör. Provet kan sedan förvaras i rumstemperatur i 12 månader (sannolikt längre tid) och kan skickas med vanlig post till laboratoriet för analys.

Priset per förpackning uppges till några dollar om man köper en större förpackning.

Även om det inte finns någon längre rapport förutom att provtagningssättet använts fram-gångsrikt vid det senaste Boston Maraton förefaller det mycket tilltalande och kan i vissa fall sannolikt vara väl så bra som DBS eftersom det är ett helt slutet system som skydda från kontaminering och inte ger upphov till någon stickskada i huden. För dopingprovtagning förefaller det mycket lämpligt, men kan sannolikt också bli till stor hjälp exempelvis i hemsjukvård.

Volumetrisk absorptiv mikrosampling (VAMS)

Volumetrisk absorptiv mikrosampling (VAMS) framträder som en värdefull teknik för insamling av torkade biologiska prover och erbjuder ett potentiellt alternativ till traditionella insamlingsmetoder. Syftet med denna studie var att bedöma lämpligheten av 30 mikroL VAMS för mätning av endogena steroidhormoner.

VAMS-procedurer har väckt ökat intresse under de senaste åren och erkänns som en innovativ och överlägsen insamlingsmetod för kvantitativa ändamål. Denna metod håller på att etableras som ett verktyg för att erhålla torkade prover av biologiska vätskor och visar på forskningsnivå sin giltighet som ett alternativ till urin-, helblods- och serumsampling i antidopningsanalys. Även om VAMS liknar DBS erbjuder det flera anmärkningsvärda fördelar. Det har potential att förbättra kvantitativ prestanda genom exakt provvolym, vilket säkerställer extraktionsutbyte och reproducerbarhet som inte påverkas av hematokrit (HCT). Idealiskt leder detta till förbättrad analytisk prestanda och en starkare korrelation med plasmavärden. Dessutom kan VAMS förenkla insamlingsprocedurer genom att leverera homogena prover med en reducerad avvisningsgrad, vilket är väsentligt i situationer med begränsad tillgång till provmaterial. Användningen av 96-brunnarsformat förbättrar dessutom tillgången till automation.

Syftet med detta arbete var att utvärdera lämpligheten av VAMS, i ett 30 mikroL-format, som en innovativ matris för mätning av nya blodmarkörer för att avslöja potentiell EAAS-dopning. En ny LC-MS/MS-metod utvecklades för kvantifiering av 18 analyter i VAMS-prover, inklusive huvudsakliga endogena fria steroider och fas II-metaboliter av androgener. Metoden genomgick validering i enlighet med ISO/IEC 17025:2017 och WADA:s krav. Därefter tillämpades den på autentiska VAMS-prover erhållna från 20 friska frivilliga för att bedöma stabiliteten hos mål-analyterna under varierande förvaringsförhållanden.

Valideringsprotokollet bedömde metodens selektivitet, matrixeffekt, extraktionsåtervinning, kvantitativa prestanda, carry-over och robusthet. Analysen av autentiska prover visade på tillfredsställande stabilitet hos övervakade steroider i VAMS lagrade i rumstemperatur, 4 °C, -20 °C och -80 °C i upp till 100 dagar och utsatta för upp till 3 frys-töcykler.

Den validerade LC-MS/MS-metoden visade sin lämplighet för mätning av steroider i torkade blod-VAMS. Den observerade stabiliteten hos steroidföreningar antyder lovande utsikter för framtida tillämpningar av VAMS, både i antidopningssammanhang och klinisk forskning.

DBS FÖR OLIKA ANALYSER

Anabola steroider i DBS

Dried blood spots (DBS) är under utvärdering och utprovning för att användas för rutinanalyser inom antidopingen, eftersom – om det fungerar – är ett enklare sätt att införskaffa, transportera och spara blodprov. För vanliga rutinblodprov finns automatiserade apparater för analyser, och för närvarande kommer även apparatur för automatisering av DBS-analyser.

I den här presenterade studien redovisas resultaten av automatiserade DSB-analys av 13 anabola steroider. Lägsta nivån för att påvisa testosteronlaurat var 0,5 ng/mL och 0,2 ng/mL för övriga steroidestrar. Metoden visade precisa resultat med liten spridning mellan olika analyser både vid låga, medelhöga och hög testosteronkoncentrationer. Förvaring i mer än 8 veckor gjordes bäst då DBS-proven förvarats i -20°C.

Testosteron på DBS

En fördel med dried blood spot (DBS)-metoden för att påvisa dopingsubstanser i blodet är att så snart blodet torkat på läskpappret så sker inge ytterligare nedbrytning av substanserna eftersom enzymerna hydrolaserna inaktiveras.

I en metodutveckling visades nu att fyra testosteronestrar (testosteron decanoate, isocaproate, phenylpropionate och propionate) kunde mätas i det torkade blodet i minst fem dagar och för tre av estrarna upp till 14 dagar.

Man kunde säkerställa att det inte var något problem att mäta i det torkade blodet på läskpappren efter några dagar i rumstemperatur, och om man förvarar läskpappersbitarna torkade kan de förvaras i minst 18 månader.

Metoden är ett ytterligare framsteg på vägen att använda DBS i dopingtester.

Jämförelse av Dried Blood Spots med traditionella analyser för testosteron

Dried Blood Spots (torkade blodfläckar, DBS) har godkänts av WADA som en alternativ biologisk matris för testning av dopningsämnen. Deras användning är dock begränsad till detektering av ämnen utan tröskelvärde och ingen miniminivå på grund av de många problem som är förknippade med kvantitativa analyser och begränsningarna i testkapaci-teterna för en hemolyserad matris.

I en studie övervakades androstenedion, testosteron och IGF-1 longitudinellt i fyra olika blodmatriser för att utvärdera potentialen för flytande kapillärblod som en alternativ matris för kvantitativ bestämning i dopningskontrollanalys.De analytiska protokoll som utvecklats för att förbereda 20 μL av de valda blodmatriserna var baserade på för testosteron och androstenedion flytande extraktion för flytande blodmatriser och på ultraljud i närvaro av metanol för torkade blodmatriser och för IGF-1 användes proteinsedimentering följt av avdunstning av överbliven vätska för att förbereda både flytande och torkade blodmatriser. Detektionen för gjordes med vätskekromatografi kopplad till masspektrometri. De analytiska arbetsflödena, när de väl optimerats, validerades helt enligt kraven från World Anti-Doping Agency och ISO 17025-standarden och användes för analys av venös (serum) och kapillär (flytande plasma och torkat helblod som samlats in med antingen volymetriska eller icke-volymetriska enheter) blodprover från 7 friska försökspersoner.

Valideringsresultaten visade tillfredsställande prestanda avseende specificitet, känslighet, matriseffekter, linearitet, noggrannhet och precision i alla utvärderade blodmatriser trots den begränsade mängden använd prov. Analysen av de olika blodmatriserna som samlats in från försökspersonerna visade icke-signifikanta skillnader mellan nivåerna av testosteron och androstenedion mätta i torkade (fast volym insamlad) och flytande matriser. En acceptabel underskattning (lägre än 15 %) observerades i kapillärplasma jämfört med venöst serum. Testosteron/androstenedion-förhållandet var likartat i alla övervägda blodmatriser (sned-vridning lägre än 5 %), vilket indikerar att denna parameter inte påverkades av vare sig blodmatrisen eller insamlingsenheten som valts. För IGF-1 skiljde sig nivåerna som mättes i flytande blodmatriser signifikant (snedvridning högre än 20 %) från dem som mättes i torkade helblodsmatriser, vilket antyder att hemolyserat blod kan utgöra en utmaning för bestämning av makromolekyler, främst på grund av hela blodmatrisens komplexitet jämfört med plasma/serum.

Resultaten av studien antyder att flytande kapillärblod kan öppna nya möjligheter för mikroblodprovtagning inom dopningskontrollområdet. Det utgör ett effektivt alternativ för att övervinna problemen med venöst blod och torkade blodfläckar. Dessutom möjliggör det också en högre frekvens av blodprovtagning, med mindre obehag och utan behov av en blodprovstagare, för analyser som endast kan utföras på blodprover, med ökad sannolikhet att upptäcka och rapportera positiva dopingprov.

Testosteronets stabilitet på DBS

Även om missbruk av testosteronestrar är utbrett inom elit- och fritidsidrotter, hämmas direkt upptäckt av intakta testosteronestrar i dopingkontrollprover av den snabba hydrolysen av esteraser som finns i blodet. Med blodfläckar på läskpapper (Dried Blood Spots, DBS) som provmatris undviks fortsatt nedbrytning av estrarna på grund av inaktivering av hydrolasenzymerna i torkat blod. Det har nu utvecklats en metod för detektion av testosteronestrar i DBS med fokus på robusthet och tillämpbarhet vid dopingkontroll. För att visa metodens genomförbarhet samlades, transporterades och lagrades DBS-prover från män som fick två intramuskulära injektioner av Sustanon® 250 (n=9) eller placebo (n=10), för att efterlikna ett dopingkontrollscenario. Den presenterade nano-LC-HRMS/MS-metoden verkade tillförlitlig och lämplig för direkt detektering av fyra testosteronestrar (testosterondekanoat, isokaproat, fenylpropionat och propionat) efter extraktion från DBS. Sustanon® detekterades hos alla försökspersoner under minst 5 dagar, med detektionsfönster upp till 14 dagar för tre av estrarna. Utvärdering av analytstabilitet visade att medan lagring vid rumstemperatur tolereras väl under några dagar, är testosteronestrar mycket stabila (>18 månader) i DBS när de lagras i frysta förhållanden. Sammantaget visar dessa fynd användbarheten av DBS-provtagning i dopningskontroll för detektion av steroidestrar. Den snabba insamlingen och minskade fraktkostnaderna för DBS jämfört med urin- respektive standardblodprover, gör metoden särskilt värdefull.

DBS för prednison, dexametason, pseudoefedrin och propranolol

För närvarande analyseras främst urin-, helblods- och serumprover för dopningsrelevanta ämnen inom professionell idrott, men nyligen har torkade blodfläckar (DBS) införts som kompletterande matris, vilket erbjuder fördelaktiga egenskaper, till exempel en minimalt invasiv provtagningsmetod.

För att hantera den ökade användningen av DBS utvecklades, optimerades och validerades en omfattande inledande testprocedur (ITP), som omfattar totalt 233 ämnen som represen-terar alla grupper på World Anti-Doping Agencys (WADAs) förbjudna lista. Provberedningen utfördes med hjälp av ett helt automatiserat system med effektiv extraktion av en 4 mm diameters fläck följt av LC-HRMS/MS-analys. Proceduren validerades framgångsrikt avseende selektivitet, detektionsgräns, reproducerbarhet, efterdrift och robusthet med avseende på en alternativ manuell provberedning, en alternativ torkad bloduppsamlings-anordning och stabiliteten hos provextrakteten. Metoden ansågs därmed uppfylla de krav som ställs i de relevanta riktlinjerna som publicerats av WADA för rutinmässig tillämpning.

Som en bevisföring analyserades DBS-prover efter administrering av glukokortikoiderna prednison och dexametason, liksom det stimulerande medlet pseudoefedrin och beta-blockeraren propranolol. Alla ämnen detekterades i prover tagna efter administrering i minst 4 timmar och upp till 24 timmar efter intag, beroende på tidsperioden för provtagningen, med hjälp av den utvecklade testproceduren. Särskilt för ämnen som endast är förbjudna under tävling kan data från DBS-prover vara användbara för tolkningen av avvikande analytiska resultat.

Sammanfattningsvis tar den utvecklade ITP hänsyn till den förväntade ökande betydelsen av DBS i framtida antidopningsanalyser och ger en grund för optimerade tillvägagångssätt för specifika ämnesklasser.

Koffeinhalt mätt med DBS efter tillförsel buccalt

Koffein är en ergogenisk substans som konsumeras globalt i många former. Användningen av buccalt absorberbara formuleringar istället för gastrointestinal upptagning har blivit alltmer populär under åren, särskilt när snabb absorption med minimal gastrointestinal stress önskas. Denna studie undersökte effekten av fem olika produkter och administrationsvägar för koffein på hela blodkoncentrationerna av koffein, paraxantin och teobromin: koffein-kapslar, tabletter, shots, påsar och tuggummin.

En enhetlig dos av koffein (200 mg) administrerades till 16 friska fritidsidrottare (26 ± 2 år) med hjälp av en randomiserad crossover-design. Prover togs i form av ried blood spots (DBS) vid 16 olika tidpunkter inom en tidsram på 2 timmar efter läkemedelstillförseln. Proverna analyserades med hjälp av en validerad metod för vätskekromatografi-tandem-masspektrometri.

Resultaten för koffein visade inga signifikanta skillnader i total biotillgänglighet (area under koncentration-tidskurva), maximal koncentration och tid till maximal koncentration. Dock, när man analyserade biotillgängligheten av koffein under de första 5, 10 och 15 minuterna, var den flytande koffeinformuleringen överlägsen andra administrerade former. Detta tyder på att koffeins löslighet har en betydande påverkan på dess absorptionshastighet. Inom idrotten måste hastigheten för koffeinabsorption beaktas, inte bara vid intag av dehydrerat koffein, utan också vid val av buccal absorption. Dessa resultat antyder att allmänna riktlinjer för ergogen användning av koffein bör beakta den använda formuleringen och motsvarande absorptionsväg.

Erytropoietinmätning i Dried Blood Spots (DBS)

Missbruket av rekombinant erytropoietin (rEPO) och andra erytropoietin-receptoragonister (ERAs) inom idrotten har lett till behovet av känsliga detektionsmetoder för dessa substanser. Torkade blodfläckprover (Dried Blood Spots, DBS) erbjuder en enkel lösning för samtidig insamling av blod och urin under dopningkontroll, men känslighetsproblem framställs ofta som en utmaning för rutinmässig EPO-analys från DBS.

Dried Blod Spots potentiella användning för att detektera rEPO-mikrodoser och EPO-genvarianten c.577del behövde därför ytterligare bevisning. Här analyserades kapillärblod som samlats in från armhuden hos 111 idrottare med Tasso-M20 (17.5 mikroL/fläck), insamlat under professionella triathlon-tävlingar. Dessutom användes venösa blodprover från friska frivilliga för att förbereda flera fläckar om 20 mikroL på Mitra VAMS (från en studie om rEPO-mikrodoser) och Whatman filterpapper (från en studie om EPO-genvariant).

Immunopurifiering av två fläckar med MAIIA EPO Purification Gel Kit och analys med natrium N-lauroylsarkosinatpolyakrylamidgel-elektrofores (SAR-PAGE)/Western blot ledde till känslig detektion av

mikrodoser av rEPO från Mitra VAMS

endogen EPO från Tasso-M20 hos alla tävlande

EPO c.577del varianten från Whatman filterpapper

Dessutom detekterades endogen EPO från tävlande i DBS även när matchande urinprover hade omätbara EPO-nivåer. Sammanfattningsvis visar detta arbete att DBS kan vara en användbar kompletterande matris till urinprover för EPO-detektion.

Erytropoietinanaloger på DBS

Erytropoietin är ett hormon som efter injektion höjer blodvärdet vid blodbrist och därför har använts som ett bloddopingmedel. Farmakologiskt har hormonet manipulerats och den tredje generationens hormon kallas för Continuous erythropoietin receptor activator (CERA).

I visa situationer har det visat sig att torkat blod på ett läskpapper (Dried Blood Spots, DBSs), som är lättare att handskas med än blodprov, går att använda för testing i antidoping-sammanhang.

Det visades nu att DBS kan användas för bestämning av CERA med en metod som ger resultat på 2 timmar. Det användes då ett kommersiellt testsätt (”ELISA”) för analysen. Metoden gav korrekta resultat i upp till 20 dagar efter en injektion med CERA.

Mikrodostilförsel av epoetin theta detekteras i DBS-prover

Rekombinant human erytropoietin (rhEPO) har missbrukats som ett prestationshöjande medel inom idrotten i flera år, men med framsteg inom detektionsmetoder kan till och med mikrodoser detekteras i torkade blodfläckprov (DBS).

Här presenteras resultaten från en studie av mikrodostilförsel av Eporatio® (epoetin theta) för att detektera rhEPO i DBS-prover. Fem friska manliga frivilliga fick en subkutan dos av 15 IU/kg Eporatio®. Urin- och DBS-prover (Mitra® VAMS och Capitainer® B50) samlades in 1, 10, 24, 36, 48 och 72 h efter läkemedelstillförseln.

Efter 1 timme var alla urinprover negativa för rhEPO, medan 40 procent av DBS-proverna ansågs vara misstänkta. Alla prover mellan 10 och 48 h var misstänkta för närvaron av Eporatio®, förutom ett urinprov som var negativt efter 48 h. Efter 72 h var 40 procent av urinproverna och 60 procent av DBS-proverna misstänkta och skulle ha gått vidare till en bekräftelseanalys.

DBS är en effektiv kompletterande matris till urin för detektion av rhEPO-mikrodoser.

ALAS2 och CA1 på DBS är känsliga och specifika markörer för rhEPO

Missbruk av rekombinant human erytropoietin (rhEPO) kan indirekt upptäckas genom idrottarens biologiska pass (ABP). Dock utmanar exponering för hög höjd tolkningen av ABP. Denna studie undersökte om 5’-aminolevulinatsynthas 2 (ALAS2) och carbonic anhydrase 1 (CA1) i kapillära torkade blodfläckar (DBSs) är känsliga och specifika markörer för rhEPO-behandling på hög höjd.

ALAS2- och CA1-uttrycket undersöktes i DBS som samlades in veckovis före, under och efter en 3-veckorsperiod på havsnivå eller hög höjd. Deltagarna tilldelades slumpmässigt 20 IU kg per kilo kroppsvikt epoetin alfa (rhEPO) eller placeboinjektioner varannan dag i 3 veckor, antingen på havsnivå (rhEPO, n=25; placebo, n=9) eller hög höjd (rhEPO, n=12; placebo, n=27). ALAS2- och CA1-uttrycket ökade upp till 300 procent respektive 200 procent vid rhEPO-behandling på havsnivå och hög höjd. När en blindad utredare tolkade resultaten hade ALAS2- och CA1-uttrycket en känslighet på 92 procent. Höjd påverkade inte tolkningen. Höjd påverkade ALAS2- och CA1-uttrycket mindre än faktiska ABP-markörer när resultaten jämfördes mellan havsnivå och höjd.

En simulerad individuell biologisk pass-metod bekräftade biomarkörens potential hos ALAS2 och CA1. ALAS2 och CA1 var känsliga och specifika biomarkörer för mikrodos rhEPO-behandling på havsnivå och hög höjd. Höjd verkade vara mindre förvirrande för dessa biomarkörer, särskilt när de kombineras. Således kan mikrodos rhEPO-injektioner upptäckas i en longitudinell blindad inställning med mRNA-biomarkörer i DBS.

DBS är effektivt för att upptäcka engångsmikrodoser av erytropoietin

Rekombinant humant erytropoietin (rhEPO) har missbrukats som en prestationshöjare inom idrotten i flera år, men med framsteg inom upptäcktsmetoder kan även mikrodoser upptäckas i torkade blodfläckar (DBS) prov. Här presenteras resultaten från en Eporatio® (epoetin theta) mikrodosadministrationsstudie för att detektera rhEPO i DBS-prover.

Fem friska manliga frivilliga fick en subkutan dos på 15 IE/kg Eporatio®. Urin- och DBS-prover (Mitra® VAMS och Capitainer® B50) samlades in 1, 10, 24, 36, 48 och 72 h efter läkemedelstillförseln. Efter 1 h var alla urinprover negativa för rhEPO, medan 40 procent av DBS-proverna betraktades som misstänkta. Alla prover mellan 10 och 48 h var misstänkta för närvaron av Eporatio®, förutom ett urinprov som var negativt vid 48 h. Efter 72 h var 40 procent av urinproverna och 60 procent av DBS-proverna misstänkta och skulle ha gått vidare till en bekräftelseanalys.

DBS är en effektiv kompletterande matris till urin för detektering av rhEPO-mikrodoser.

Avslöjande av homologa blodtransfusioner genom SNP på DBS

Vi genomförde genotypningsanalys av mänskliga biallela polymorfismer (single nucleotide polymorphisms) för att detektera homolog blodtransfusion vid doping. DNA extraherades från torkade blodfläckar (DBS) och kvantifierades med hjälp av realtids, snabb PCR. Metoden visade sig möjliggöra detektion av transfusioner upp till en donatorandel på 1 procent, med en betydande förbättring av känsligheten jämfört med både den referenscytoflörometriska metoden och en tidigare föreslagen strategi baserad på DNA STR-baserad metod.

Diagnostik av bloddoping med genteknik på DBS

Det gjordes genotypningsanalys av mänskliga biallela polymorfismer (enkelnukleotid-polymorfismer) för detektering av homolog blodtransfusion vid dopning inom idrotten. DNA extraherades från torkade blodfläckar och kvantifierades med hjälp av realtids snabb PCR. Metoden visade sig möjliggöra detektion av transfusioner upp till en donatorandel på 1 procent, med en betydande förbättring av känsligheten jämfört med både den referens-baserade cytoflorimetrimetoden och en tidigare föreslagen strategi baserad på DNA STR-baserad metod.

Formulärets överkant

Nytt sätt att beräkna retikulocytkoncentration på DBS vid bloddoping

En av de viktigaste parametrarna i blodpasset är koncentrationen av retikulocyter, det vill säga de röda blodkroppar som är upp till ett dygn gamla och därigenom speglar nybildnings-hastigheten på de röda blodkropparna. I mikroskopet framträder de cellkärnerester av ribosomalt RNA som ett nät (”reticulum”) med hjälp av färgning med exempelvis metylenblått. Fram till idag har man beräknat koncentrationen retikulocyter med automatiska räknare av röda blodkroppar där retikulocyterna urskiljts genom en kombination av laserexitering, färgning av RNA och DNA och speciella detektorer.

Det har nu tagits fram en alternativ metod för retikulocytbestämning som lämpar sig bra för DBS (Dried Blood Spot). Man använder två proteiner som i blod bara finns i retikulocyterna, CD71 och ferrochelatase (FECH) och en som finns i alla röda blodkroppar, Band 3.

Man testade nu metoden genom att ge låga doser EPO (40 IU/kg rhEPO) eller koksaltslösning till 20 friska personer. De genomsnittliga kvoterna CD71/Band 3 och FECH/Band 3 ökade med 412 ± 197 respektive 250 ± 44 procent medan denb biomarkör som idag används i blodpasset, RET%, ökade med 195 ± 35 procent. Vid undersökning dag 35 och dag 39 ökade CD71/Band 3 relativt koksaltlösning med 127 ± 25 och 139 ± 36 procent medan man inte såg någon ökning alls av RET%. CD71/Band 3 förblev under 75 procent av baslinjevärdet under minst 4 veckor efter erytropoietininjektionen, medan RET% återgick till baslinjen.

Den refererade metoden förefaller vara ett bättre sätt att mäta retikulocytkoncentrationen på, åtminstone om man använder DBS.

Effekterna av järninjektion på bloddopningsbiomarkörer i DBS

Järntillskott betraktas inte som en dopningsmetod men det kan påverka nivåerna av flera biomarkörer i den hematologiska modulen i det biologiska idrottspasset (ABP), såsom retikulocytprocenten (%RET) och hemoglobinnivån (Hb). Järninjektion kan alltså vara en faktor vid antidopinganalyser som gör resultaten mer svårtolkade.

Tidigare studier har föreslagit att Hb-nivån och expressionsnivåerna av retikulocytrelaterade mRNA, såsom 5’-aminolevulinatsyntas 2 (ALAS2) och kolsyraanhydras 1 (CA1), kan vara lovande biomarkörer för ABP och detekterbara i fläckar av torkat blod (DBS). Därför undersökte man i denna studie effekten av järninjektion på nivåerna av dessa potentiella biomarkörer i DBS.

Retikulocytrelaterade mRNA-analyser utfördes med RT-qPCR. Ferritinnivån i DBS mättes med enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) metod. Noterbart fanns det inga signifikanta effekter av järntillskott på nivåerna av ALAS2 och CA1 mRNA, men däremot ökade %RET och omogna retikulocytfraktion (IRF) mätt i helblod signifikant efter järninjektion. Som förväntat ökade järntillskott ferritinnivån signifikant i både serum- och DBS-prover.

Sammanfattningsvis förstärker dessa fynd specificiteten hos retikulocytrelaterade mRNA:er i DBS:er som biomarkörer för bloddopning till mål i antidopinganalyser. %RET och omogna retikulocytfraktioner (IRF) mätt i helblod ökade signifikant efter järninjektion. Som förväntat ökade järntillskott ferritinnivån signifikant i både serum- och DBS-prover.

DBS VID INTERNATIONELLA TÄVLINGAR

Dried Blood Spot (DBS) vid Vinter-OS 2022

Författarna till denna översiktsartikel anger att de arbetar på den kinesiska antidopingorganisationen (China Anti-Doping Agency, No.1 Anding Road, Beijing, PR China).

De redovisar fördelarna med de torkade bloddropparna som att de besvärar idrottsutövarna mindre än sedvanliga blodprov samtidigt som de underlättar transporter och förvaring.

I artikeln framgår att WADA beslutat att man skall använda DBS-tekniken vd OS och Paraolympiaden i Beijing 2022 i rutintestning trots att metoden knappast kan betecknas som helt färdigutvecklad.

URINPROV

Torkade urinprov (Dried Urine Spots, DUS)

Under senare år har man gjort stora framsteg acseende ett förenklat system för att analysera torkade blodprov (Dried Blood Spots, DBS). Det redovisas nu ett utvecklingsarbete där man försöker göra liknande analyser men istället på torkade urinprov (DUS). Detta skulle främst kunna vara ett alternativ när det gäller peptidhormoner (tillväxthormon och olika erytropoeitiner) som endast kan påvisas under någon eller några dagar i blod.

Man använde nu samma läskpapper som vid DBS och torkade urinprover med. Man undersökte nu bästa metoderna för torkning, förvaring och transport för proverna för att sedan analysera dom avseende peptidhormoner.

Man visade nu att jämfört med vanliga urinprov som förvarats frusna i -20 oC respektive -80 oC där man förlorade upp till 55 respektive 29 procent av det man önskade mäta så förlorade man under 90 dagar bara 29 procent om man förvarade DUS i rumstemperatur.

Fördelarna med fungerande DUS-system är således många och förhoppningsvis kan vidare utveckling göra denna metod möjlig för rutinbruk.

REFERENSER