Nya skarpa metoder för gendoping

Nya skarpa metoder för gendoping: oligonekleotider

Under de senaste två decennierna har Europeiska läkemedelsmyndigheten (EMA) och USA:s livsmedels- och läkemedelsmyndighet (FDA) godkänt flera genterapier. En kategori är oligonukleotidterapier, som möjliggör reglering av uttrycket av målgener. Förutom redan godkända terapier pågår flera prekliniska och kliniska studier. Ur ett regulatoriskt perspektiv har EMA kategoriserat genterapiprodukter som en undergrupp av “läkemedel för avancerad terapi” (ATMPs). Dessa produkter definieras vidare som ”biologiska produkter med en aktiv substans som innehåller en rekombinant nukleinsyra i syfte att reglera, reparera, ersätta, lägga till eller ta bort en genetisk sekvens, och som ska ha en terapeutisk, förebyggande eller diagnostisk effekt på patienten.” Vacciner ingår dock inte i denna kategori på grund av deras förebyggande effekt mot infektionssjukdomar. Genterapins tillämpningsområde är behandling av cancer eller sällsynta genetiska sjukdomar. De första genterapierna som godkändes av EMA respektive FDA under 2012 och 2017 var båda baserade på överföring av gener via adeno-associerade virus (AAV). Denna vektorbaserade introduktion av främmande deoxiribonukleinsyra (DNA) leder till uttryck av ett funktionellt protein in vivo. Till skillnad från denna princip har forskningen även fokuserat på andra metoder som syftar till att modulera uttrycket av kroppens egna gener eller genomredigering. Det senare bygger på CRISPR/CAS9-baserad redigering av genomet.

WADA förbjuder användningen av ”nukleinsyror och analoger till nukleinsyror som kan förändra genomsekvenser och/eller förändra genuttryck genom någon mekanism” som en icke specificerad metod. Därför skulle administrering av nukleinsyror eller dess analoger av idrottare innebära ett brott mot antidopingsreglerna. I denna översikt diskuteras typer av oligonukleotidterapier, deras potentiella missbruk inom idrotten samt aspekter av prov-beredning och masspektrometriska metoder i relation till antidopingsanalys.

Utvecklingen av så kallade oligonukleotidbaserade terapier möjliggör en mängd olika former av genreglering. Oligonukleotider är små syntetiska nukleinsyror, antingen enkel- eller dubbelsträngade, som verkar på sina mål genom Watson–Crick-basparning med komple-mentära ribonukleinsyra (RNA)- eller DNA-sekvenser.

Oligonukleotidterapier inkluderar antisensoligonukleotider (ASOs), små interfererande RNA (siRNA), mikroRNA (miRNA)-mimetika, små hårnåls-RNA (shRNA), budbärar-RNA (mRNA) och små aktiverande RNA (saRNA).

ASOs är korta enkelsträngade molekyler (13–30 nukleotider) som binder till ett komplemen-tärt RNA-mål. Beroende på deras verkningssätt kan de delas in i två grupper: genuttrycks-hämmare och splitsningsmodulatorer. Hämmning av målgener uppnås vanligtvis genom RNas H, som bryter ner mål-RNA:t i ASO–RNA-komplexet. Pre-mRNA-splitsning kan påverkas av ASO:s som antingen medierar exon-skipping eller exon-inkludering. Utöver detta kan ASOs också indirekt påverka uttrycket av en målgen genom att binda till miRNA och därigenom förhindra miRNA från att binda till mål-mRNA:t. Dessa ASOs kallas antagomiRs eller miRNA-hämmare.

För att minska snabb nedbrytning av endogena nukleaser har ASO:er modifierats i stor utsträckning. Dessa modifieringar omfattar förändringar av ryggraden (fosforotioater, PS; fosforodiamidat-morfolino-oligomerer, PMO), sockermodifieringar såsom 2′-O-metyl (2′-OMe), 2′-O-metoxi-etyl (2′-MOE), öppna ringformade sockerderivat eller 2′-fluoro (2′-F)-grupper, samt nukleotidbasmodifieringar som införande av 5-metylcytosin (5mC) eller konjugering med N-acetylgalaktosamin (GalNAc), vilket möjliggör leverriktad leverans.Vidare är dessa modifieringar fördelaktiga eftersom de minskar immunmodulerande effekter och eliminerar behovet av en extra bärare för leverans.

Förutom ASO:er är siRNA:er den näst vanligaste typen av oligonukleotidterapier. Ett siRNA är ett dubbelsträngat RNA som är mycket specifikt för ett visst mRNA. Genavstängning uppnås genom att en av siRNA-strängarna (guide-strängen) binder till Argonaute 2 (Ago2)-proteinet i RNA-induced silencing complex (RISC). Det aktiverade RISC-komplexet bryter ner mål-mRNA:t, som sekvensspecifikt känns igen och binds av siRNA:s guide-sträng. Ribosmodifieringar (2′OMe, 2′-F) och modifieringar av ryggraden används även för kemisk stabilisering, liknande som hos ASO:er. Dessutom är de flesta siRNA-terapier GalNAc-konjugerade för att rikta sig mot levern via underlättat cellulärt upptag i hepatocyter genom asialoglykoproteinreceptorn.

Till skillnad från siRNA:er kan ett miRNA-mimetikum modulera många mål och kan därför användas i behandlingar som riktar sig mot flera gener samtidigt. Mekanismerna för siRNA och miRNA-mimetika sammanfattas ofta som RNA-interferens. Hittills har dock inga miRNA-mimetikaterapier blivit godkända.

En annan möjlig verkningsmekanism är RNA-aktivering (RNAa) via saRNA:er. Endogent ökar dessa dubbelsträngade RNA (21 nukleotider) genuttrycket antingen reversibelt genom bindning till promotorregioner eller mer långsiktigt genom epigenetiska förändringar. Likt siRNA binder saRNA till Ago2 och bildar RNA-induced transcriptional activation complex (RITA) tillsammans med RNA-helikas A och ett RNA-polymerasassocierat protein. Även om inga saRNA-terapier ännu är godkända, finns ett växande intresse för denna mekanism, med kandidatterapier i preklinisk utveckling. Dessutom undersöks ett saRNA-läkemedel för behandling av levercancer i en fas II-studie.

mRNA är enkelsträngade RNA-molekyler som består av en öppen läsram (ORF), flankerad av en 5′ och en 3′ icke-translaterad region (UTR). I 5′-änden finns en modifierad guaninbas (den så kallade 5′-hatten), och i 3′-änden finns en sekvens med flera adenosiner (så kallad poly(A)-svans). mRNA-terapier har utvecklats för vaccination mot infektionssjukdomar, som proteinersättning eller för tumörimmunterapi.

På senare tid har även antikropp–oligonukleotid-konjugat (AOC:s) hamnat i fokus. Likt antikropp–läkemedelskonjugat kombinerar AOC:er antikroppars selektivitet för specifika målcellstyper med effektiviteten hos den kopplade nyttolasten. I nuvarande AOC:er består denna nyttolast av antingen siRNA eller ASO:er. Specifika aspekter av AOC:er har nyligen granskats av Dugal-Tessier med flera. På grund av lovande effekter i en aktuell klinisk prövning har FDA i USA beviljat “breakthrough therapy”-status för den första AOC:n, delpacibart etedesiran (del-desiran), under 2023. Det förväntas att fler AOC:er kommer att utvecklas inom en snar framtid.

I maj 2024 har totalt 16 oligonukleotidbaserade terapier godkänts av FDA och EMA; däribland 10 ASO:er, fem siRNA:er och en RNA-baserad aptamer. Flera andra utvärderas för närvarande i fas III-prövningar, och måste därför ses som kandidater för framtida godkännande. Bland dessa läkemedel riktar sig majoriteten mot levern (mipomersen, patisiran, inotersen, givosiran, volanesorsen, lumasiran, inclisiran och vutrisiran). Fyra av de 16 godkända oligonukleotidbaserade läkemedlen riktar sig mot muskelvävnad, två mot ögat (formivirsen och pegaptanib), och två mot centrala nervsystemet (nusinersen och tofersen).

Potentiellt dopingrelaterade terapeutiska mål

När det gäller potentiellt missbruk av idrottare kan mål relaterade till prestationshöjning eller påskyndad återhämtning vara av intresse. De årligen publicerade antidopingstatistiken visar att inte bara godkända läkemedel missbrukas för prestationshöjande syften. Därför inklu-derar vi här både godkända oligonukleotidterapier samt icke-godkända som hittills endast testats i prekliniska modeller men vars effekter skulle kunna vara intressanta som dopingmål i idrott.

För det första är det tänkbart att rikta in sig på det muskuloskeletala systemet genom att hämma muskelnedbrytning eller främja myoblastproliferation. Muskeldystrofi (MD) omfattar genetiska sjukdomar som orsakar muskelsvaghet och en progressiv förlust av muskelmassa. Bland alla kända muskeldystrofier har Duchennes muskeldystrofi (DMD) den högsta och Beckers muskeldystrofi (BMD) den näst högsta förekomsten i världen. De ansvariga mutationerna finns i dystrofingenen (DMD) som är X-kromosombunden och kodar för ett protein som är avgörande för muskelstyrka och stabilitet i muskelfibrer.

Förutom farmakologiska terapier såsom antiinflammatoriska eller antioxidativa behandlingar, eller behandlingar som syftar till att normalisera intracellulära Ca²⁺-nivåer, har antisens- och genterapeutiska metoder blivit föremål för forskning och utveckling. Den första studien som undersökte potentialen för en antisensbaserad metod att återställa funktionellt dystrofinuttryck i en MD-musmodell publicerades 2001.

För närvarande finns fem oligonukleotidterapier godkända för behandling av DMD (Exondys 51, Vyondys 53, Waylivra, Viltepso, Amondys) och en för spinal muskelatrofi (Spinraza), där samtliga sex är antisensoligonukleotider (ASO:er).

När det gäller potentiellt missbruk för prestationshöjning inom idrott verkar en administrering av dessa godkända oligonukleotidterapier för sällsynta sjukdomar vara osannolik, eftersom de endast är effektiva hos personer som bär på mutationer i dystrofingenen.

Det finns dock andra mål inom det muskuloskeletala systemet som kan vara av intresse. Det mest studerade är myostatin, en myokin som negativt reglerar muskeltillväxt. Genom att hämma uttrycket av myostatin med siRNA har en ökning i muskelfiberstorlek och muskel-massa visats i både möss och fisk. Dessutom har användningen av en okta-guanidin-morfolino-oligomer också inducerat ökad skelettmuskelmassa i både normala och kakexiska möss.

Nyligen har en ASO som riktar sig mot en splitsningsförstärkare i exon 1 av MSTN-genen beskrivits som en nyupptäckt myostatinhämmare. Även om endast prekliniska studier i gnagare eller fisk har utförts, finns det potential för oligonukleotidbaserade metoder att öka muskelmassa genom att rikta sig mot myostatin.

Vidare kan myostatinuttryck hämmas genom att rikta in sig på reglerande miRNA. Det har visats att en intramuskulär injektion av en plasmid som uttrycker miR-27a i möss signifikant ökade muskelfibrernas tvärsnittsarea.

Principiellt sett kan även delar av myostatinets signalväg vara möjliga mål för en oligo-nukleotidbaserad terapeutisk metod med målet att öka muskelmassa. Bland dessa mediatorer är transkriptionsfaktorn FoxO-1 avgörande för regleringen av skelettmuskelns differentiering, och dess hämning med en ASO i möss har kopplats till ökad muskelmassa.

Dessutom är myostatinbindande proteinet follistatin (Fst) av intresse, eftersom det blockerar myostatinets signalväg och därigenom också ökar skelettmuskelmassan. Baserat på detta är myostatinhämmare, inklusive Fst, förbjudna inom idrotten under kategori S4 (Figur 1). Förutom administrering av rekombinant Fst är det möjligt med genterapi riktad mot Fst för att öka det endogena uttrycket av proteinet. Även om en ökning av skelettmuskelmassa efter AAV-medierad genterapi med Fst har visats i prekliniska studier och kliniska prövningar på patienter med muskeldystrofi, finns det ännu inget godkänt läkemedel för genterapi med Fst.

Proteinet alfa-klotho (klotho), i sin membranbundna form, fungerar som en medreceptor för olika fibroblasttillväxtfaktorreceptorer (FGFR), och dess kluvna lösliga form verkar som ett proteohormon med olika funktioner. Sedan det först beskrevs har det kallats för ”långt-levnadsgenen” på grund av den förlängda livslängden hos möss med överuttryckt klotho. Klotho har även visats ha funktion inom muskler, då klotho-brist har kopplats till sarkopeni hos både möss och människor.

I motsats till detta har överuttryck av klotho – antingen i en transgen musmodell eller via AAV-leverans – ökat fysisk prestation hos möss samt ökat muskelstyrkan. Dessa effekter tros bero på klothos påverkan på muskelregeneration och muskelsatellitcellers funktion. Dess-utom har högre klothonivåer hos medelålders och äldre människor korrelerats positivt med muskelstyrka och negativt med skörhet. Baserat på dessa observationer är klotho ett intressant terapeutiskt mål, även om inga metoder ännu har testats i människa.

Ytterligare terapeutiska mål med potentiell relevans för doping inkluderar tillväxthormon (GH) och insulinliknande tillväxtfaktor 1 (IGF-1). Möjligheten att öka GH-nivåer har visats i möss med hjälp av ett icke-viralt, icke-integrerande liposombaserat vektorsystem, som efter en till två injektioner gav låg toxicitet och långvarigt förhöjda terapeutiska GH-serumnivåer. För närvarande finns inga tillgängliga data om möjliga försök på människor.

Förutom att leverera Igf-1-genen kan IGF-1-signaleringen även förstärkas genom att rikta in sig på IGF-bindande proteiner (IGFBP). Nyligen visades att IGF-1-signaleringen kunde förstärkas genom att med ASO sänka uttrycket av IGFBP-1 och IGFBP-3 i C2C12-celler. I kontrast till resultaten in vitro kunde dock inget exon skipping bevisas i en musmodell, vilket forskarna förklarar med dålig leverans av ASO:erna till målvävnaderna.

Dessutom kan lokal injektion av IGF-1 mRNA i skelettmuskulatur också vara ett alternativ för prestationshöjning. En nyligen genomförd studie visade på regenerativ potential hos IGF-1 mRNA med optimerade signalpeptider i en musmodell för muskelskada samt i en kanin-modell för ryggdiskbråck.

Mål relevanta för prestationshöjning inkluderar också de som är involverade i ökad uthållighet, hemoglobinnivå eller maximal syreupptagningsförmåga. Ett terapeutiskt läkemedel baserat på AAV-medierad leverans av erytropoietin-genen är Repoxygen®, som endast testats i prekliniska djurmodeller och vars utveckling avbröts 2003. Trots detta rapporterades det i samband med en rättsprocess om doping inom idrott redan 2006.

Det finns också ett aktivt patent på olika ASO:er för behandling av EPO-relaterade sjuk-domar, men ingen klinisk prövning har ännu inletts. Vidare är det möjligt att administrera EPO-mRNA, vilket har undersökts i studier på möss, råttor, grisar och apor, och därmed lett till ökat uttryck av EPO-protein och ökade blodcellnivåer.

Överuttryck av en exogent administrerad EPO-gen kan alltså resultera i prestationshöjande effekter. Det senaste fyndet av transgen EPO-DNA i två svarta marknadsprodukter märkta som material innehållande EPO- och IGF-1-gener för potentiell gendoping inom idrotten pekar på att icke-godkända genterapeutiska substanser finns tillgängliga.

Användning av icke-godkända produkter innebär emellertid alltid en betydande hälsorisk för användarna. Eftersom tillgången till oligonukleotidterapier kan vara begränsad på grund av höga kostnader eller avsaknad av godkännande, kan den svarta marknaden bli en potentiell källa. Preparat som finns tillgängliga där kan dock vara felmärkta, kontaminerade eller innehålla orenheter – precis som redan visats med illegala produkter som används för prestationshöjning och som exempelvis innehåller anabola androgena steroider eller tillväxthormonfrisättande peptider.

Referens: Parr MK, Keiler AM. Oligonucleotide therapeutics in sports? An antidoping perspective. Arch Pharm (Weinheim) 2025 ;358: e2400404.