Aktuellt om möjligheter att upptäcka gen- och celldoping

Aktuellt 2025 om möjligheter att upptäcka gen- och celldoping

Mot bakgrund av de betydande och snabbt framväxande framstegen inom modifiering, manipulering och påverkan av genuttryckshastigheter har utvecklingen av detektions-strategier för potentiella former av gendoping nödvändigtvis och oundvikligen blivit ett priori-terat ämne inom antidopingforskning. Med allmänna principer för till exempel transgen-detektion redan på plats i antidopinglaboratorier, krävs alternativa och/eller heltäckande kompletterande metoder – både med tanke på den växande listan av potentiella mål-gener (som antas positivt påverka idrottsprestationer) och det ökande antalet kodonoptimerade varianter som kan minska eller till och med upphäva detektionsförmågan hos enskilda testmetoder. Samtidigt gäller restriktioner och begränsningar för icke-biaserade genomiska profilanalyser, särskilt i syfte att användas för dopningstester inom idrotten.

Det har etableradts en musmodell för att utvärdera detektionsstrategier vid administrering av transgener via en rekombinant adenoassocierad virusvektor (rAAV), med det humana erytropoietingenen (rAAV9-hEPO) som exempel. Efter injektion av rAAV9-hEPO-vektorn samlades blodprover (50 μL) in upp till 30 dagar och analyserades med Taqman qPCR, riktad mot två EPO-exon–exon-övergångar samt ett cytomegaloviruspromotorelement (CMVp). Detta visade att transgenen kunde spåras i upp till 30 dagar, med en analys-sensitivitet som krävde 34–104 kopior av det virala genomet per mikroL. Dessutom rapporterades kraftigt uppreglerade genuttrycksprofiler för asparaginsyntetas, serinhydroxy-metyltransferas och metylenetetrahydrofolatdehydrogenas, och möjligheten att inkludera dessa i framtida ABP-övervakningsprogram diskuterades.

Behovet av robusta testmetoder underströks av en studie, som rapporterade om identif-ieringen av produkter (marknadsförda för prestationshöjning och köpta från internetbaserade leverantörer) som innehöll transgent EPO-DNA. En testmetod som möjliggjorde samtidig detektion av sju transgenmål (erytropoietin, follistatin, GH1, myostatinpropeptid, IGF1 samt vaskulär endotelial tillväxtfaktor A och D) utvecklades. Denna metod använde multiplexad PCR-baserad amplifiering av minst två exon–exon-övergångsregioner för varje transgen. Ampliconerna användes för enkelbasförlängningsreaktioner, och detektion av enkelbasför-längda primrar via MALDI-MS bekräftade förekomsten av en transgen, såsom i det aktuella fallet för EPO.

Genom att utnyttja specificiteten hos Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) och CRISPR-associerade (Cas) proteinbaserade reaktioner har presenterats en snabb och multiplexad testanordning för att detektera sex transgener (vaskulär endotelial tillväxtfaktor A, HIF1, EPO, GH1, IGF1 och alfa-aktinin-3) i helblod. I ett åttakanaligt mikrofluidikchip tilldelades sex kanaler var sin transgen (plus två negativa kontroller), där rekombinaspolymerasamplifiering (RPA) och CRISPR-RNA (crRNA)-designer, specifikt riktade mot transgenens exon–exon-övergångar, fick verka i följd. I kombination med Cas12a och en karboxyfluorescein-märkt rapportersond erhölls testresultat inom 40 minuter vid en koncentration på 10⁻¹⁸ mol/L.

Som proof-of-concept fick möss en injektion av 0,4–10 mikroL av ett rAAV9-hIGF1-konstrukt (total virustiter = 5,26 × 10¹² vg/mL) eller ett naket hEPO-plasmid (25–100 mikrog), och blodprover (100 mikroL) samlades in under 20 respektive 2 dagar. Analyserna möjliggjorde en tydlig åtskillnad mellan negativa kontroller och blodprover efter administrering, även om skillnaden i signalstyrka för hEPO-experimentet diskuterades som mindre framträdande jämfört med rAAV-baserade interventioner.

Förutom möjligheten att använda CRISPR/Cas-systemet för att detektera transgener visades det också kunna användas för analys av CRISPR/Cas-baserade genredigeringsförsök. Genom att tillämpa liknande principer som ovan riktades denna metod mot den konserve-rade regionen av CRISPR:s single guide RNA (sgRNA) associerad med Streptococcus pyogenes. Denna region amplifierades först med omvänt transkriptas (RT)-RPA och exponerades därefter för CRISPR/Cas13a med ett specifikt crRNA i närvaro av en fluorescensmärkt rapportersond känslig för RNAse-aktivitet. Även här användes en musmodell för att bedöma metodens användbarhet. Intravenös och intramuskulär injektion av 600 pmol sgRNA kunde detekteras i alla blodprover som samlades in under 24 timmar, och metodens detektionsgräns uppskattades till 1 fM vid användning av 100 mikroL serum.

Referens: Thevis M, Kuuranne T, Geyer H. Annual banned-substance review 17th edition-analytical approaches in human sports drug testing 2023/2024. Drug Test Anal 2025; 17: 1417-42.