En ny potentiell dopingsubstans, Polydeoxiribonukleotid (PDRN)

En ny potentiell dopingsubstans: Polydeoxiribonukleotid (PDRN)

Polydeoxiribonukleotid (PDRN) är en FDA-godkänd läkemedelsingrediens som utvinns från ägg eller testiklar från fiskar såsom Oncorhynchus mykiss (regnbågsöring) eller Oncorhynchus keta (kungsörnslax). PDRN består av DNA-fragment med låg molekylvikt, mellan 50 och 1500 kDa. PDRN är känt för sina sårläkande egenskaper och används i olika formuleringar, inklusive ledinjektioner, dermala fillers, hudvårdsprodukter, ögondroppar och kosttillskott. De sårläkande effekterna av PDRN har tillskrivits stimuleringen av adenosin A2A-receptorer, som spelar en central roll i celltillväxt, angiogenes, syreförbrukning, ischemi och reglering av inflammation. Många djurstudier har därför visat att administrering av PDRN leder till ökad uttrycksnivå av tillväxt- och erytropoesfaktorer, inklusive vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF), fibroblasttillväxtfaktor (FGF) och hypoxiinducerande faktor 1 (HIF-1).

PDRN används ofta i injicerbara formuleringar baserade på hydrogel i kombination med ämnen som alginat, kitosan, hyaluronsyra och poly(laktid-ko-glykolid), vilket ger synergistiska effekter och visar snabbare sårläkning och benregeneration jämfört med att använda enbart PDRN. Materialegenskaperna hos PDRN, en negativt laddad nukleinsyra med viskösa egenskaper, gör att det enkelt kan bilda kompositer med andra ämnen som redan används för att minska ledsmärta och som dermala fillers. Dessa hydrogelbaserade injektioner har redan kommersialiserats globalt som medicintekniska produkter, med större tillverkare som inkluderar sex företag i Korea, tre i Kina, ett i Frankrike och ett i Italien. I takt med att PDRN-produkterna fortsätter att diversifieras, förväntas marknaden växa från 4,47 miljarder USD år 2022 till 7,68 miljarder USD år 2025.

Även om PDRN i första hand skall ses som fördelaktigt för sårläkning, kan idrottare missbruka den sårläkande mekanismen för att förbättra sin prestationsförmåga. WADA inkluderar ett ämne på sin förbjudna lista om det uppfyller två av tre kriterier, vilka definieras som: potential att förbättra idrottsprestation, faktisk eller potentiell hälsorisk för idrottaren, samt brott mot idrottens anda. Bland dessa kan PDRN uppfylla två kriterier: dess potential att förbättra prestationsförmågan och de hälsorisker det medför.

När det gäller prestationsförmåga, har ett läkemedelsföretag rekommenderat administrering av PDRN till idrottare, och många studier har visat ett direkt samband mellan PDRN och idrottsprestation. En studie visade att administrering av PDRN till råttor med senskador ledde till högre uttryck av VEGF och FGF samt snabbare sensläkning jämfört med en koksalt-behandlad grupp. En annan studie visade att PDRN-administrering till kaniner med förtvi-nade vadmuskler ökade VEGF-uttryck och fördubblade tvärsnittsarean på muskelfibrerna, vilket resulterade i snabbare muskelregeneration än koksaltsgruppen. Användningen av PDRN som ledinjektion minskade signifikant inflammationen och lindrade smärta. Detta beror inte bara på PDRN:s farmakologiska egenskaper utan också på dess höga visko-elasticitet, vilket gör att det fungerar som ett smörjmedel i brosket. Denna egenskap kan också kopplas till förbättringar i prestationsförmåga relaterad till uthållighet.

När det gäller det andra kriteriet för förbjudna ämnen – potentiella hälsorisker för idrottare – är det känt att ökade nivåer av VEGF och HIF-1 från PDRN-administrering ökar risken för tumörer, och dessa tillväxtfaktorer är därför också förbjudna av WADA. Dessutom är PDRN vanligtvis utformat för att användas som ledinjektion eller dermal filler och administreras av kliniker; men injicering i icke-godkända områden, såsom muskler, innebär betydande säkerhetsrisker, särskilt med tanke på risken för missbruk bland idrottare.

Ur ett annat perspektiv har WADA inkluderat gen- och celldoping som en förbjuden metod sedan 2003, vilket definieras som användning av nukleinsyror eller analoger till nukleinsyror som kan förändra genomsekvenser och/eller påverka genuttryck genom någon mekanism, enligt avsnitt M.3.1 på den förbjudna listan. Eftersom listan inte specificerar någon särskild form av gen- eller celldopingsmetod, skulle användningen av PDRN-injektioner och hydrogeler för att förbättra idrottsprestation kunna betraktas som gen- och celldoping. Eftersom PDRN är en nukleinsyreanalog och in vivo-studier har visat ökat uttryck av förbjudna tillväxtfaktorer, föreslår vi här för första gången att PDRN kan användas som dopingsmedel av idrottare och att dess användning bör regleras.

För att kontrollera gen- och celldopning publicerade WADA sina första riktlinjer för att upptäcka gen- och celldopning år 2021, vilka inkluderade metoder baserade på polymeraskedjereaktion (PCR). Även om riktlinjerna anger kriterier för testprestanda, såsom att PCR-metodens känslighet ska vara minst 10 kopior, saknas detaljer som primers-sekvenser, PCR-villkor eller analytiska metoder. Som ett resultat finns det i dagsläget inga ackrediterade testmetoder för gen- och celldopning. Med tanke på att PDRN redan finns kommersiellt tillgängligt som ett injicerbart läkemedel, antingen ensamt eller i kombination med hydrogelkomponenter, finns det ett behov av en detektionsmetod som direkt riktar sig mot dess nukleinsyrasekvens. Eftersom PDRN härrör från lax-DNA, är det nödvändigt att rikta in sig på laxspecifikt DNA, exempelvis mitokondriellt ribosomalt DNA. Dessutom, eftersom halveringstiden för PDRN är cirka 3 timmar, krävs en känslig detektionsmetod för att uppfylla WADA:s krav på en känslighet om 10 kopior. Eftersom PDRN utsöndras via urinen och dopningsanalyser omfattar både blod- och urinprov, behövs också en analysmetod som fungerar i båda matriserna.

I denna studie utvecklade vi en analysmetod för PDRN med hjälp av CRISPR-associerat protein Cas12a kombinerat med direkt PCR. Cas12a är ett nukleas som uppvisar cis-klyvningsaktivitet på mål-DNA (dubbelt strängat DNA, dsDNA) och trans-klyvningsaktivitet på icke-mål enkelsträngat DNA (ssDNA). När målets dsDNA matchar CRISPR-RNA (crRNA) som komplexerats med Cas12a, klyver enzymet en fluorescens-/quenchermärkt ssDNA (en så kallad “fluorescensreporter”), vilket ger en fluorescerande signal beroende på förekomsten av målet.

Med utnyttjande av denna egenskap utformades en direkt PCR för att anrika PDRN från mänskligt plasma och urin utan behov av DNA-extraktion, vilket påskyndar analysen. Direkt PCR riktades mot både 12S rDNA och 16S rDNA från Oncorhynchus mykiss och Oncorhynchus keta för att specifikt amplifiera målet i mänskliga plasma- och urinprover. Genom att kombinera Cas12a/crRNA:s målspecifika fluorescenssignal med direkt PCR, syftade denna studie till att utveckla en enkel och känslig metod för att detektera PDRN och visa dess tillämpbarhet i opurifierade mänskliga prover. Metoden visade hög känslighet och kunde detektera så lite som 0,8 pikogram (0,3 genomkopior) av O. keta-DNA i 10 mikroL biologiska prover inom 90 minuter – vilket överträffar detektionsgränserna för många nuvarande dopningsmedel.

Referens: Yi JY, Park S, Kim M, Jeong Y, Shin H, Cho Y, Jeon M, Oh MK, Sung C. Emerging wound-healing injectable polydeoxyribonucleotide: potential as a prohibited doping method and its simple detection via CRISPR/Cas12a system. Int J Biol Macromol 2025; 309(Pt 3): 142999.