GENDOPING

(Senast reviderad 2026-01-23)

GENDOPING

Svenska Antidopingbiblioteket

Innehåll

INTRODUKTION

Översikt

Efter de första officiella diskussionerna år 2001 av “Gene Therapy Working Group”, sammankallad av International Olympic Committee (IOC) Medical Commission, förbjöds explicit gendopning enligt regelverken från World Anti-Doping Agency (WADA) år 2003. Genetiska terapeutiska in vivo-metoder är baserade på överföring av nukleinsyror eller nukleinsyraanaloga in i människokroppen, exempelvis via intravenösa eller direkta vävnadsinjektioner (till exempel intramuskulära). Överföring av transgena DNA-sekvenser kan uppnås med olika strategier, inklusive användning av rekombinanta virala vektorsystem (som adenovirala eller adeno-associerade virala (AAV) system) eller icke-virala vektorer (som bakteriella plasmider eller minicircle-DNA) som antingen kan överföras “nakna” (ofta assisterade av fysisk kraft) eller komplexerade med till exempel kationiska lipider eller polymerer. Med förbättrade produktions-, leverans- och uttryckstekniker förutsägs en ökad överföring av genetiska terapeutiska metoder till klinisk standardvård och deras kommersia-lisering på läkemedelsmarknaden, vilket gör gendopningsincidenter allt mer sannolika.

År 2021 godkände WADA det första testprotokollet för genetisk dopingdetektion, avsedd för påvisning av exon–exon-anslutningar hos intronlösa komplementärt DNA (cDNA)-sekvenser av den mänskliga erytropoietingenen (EPO) i helblod, genom användning av kvantitativ realtids-PCR (qPCR). Andra metodologiska tillvägagångssätt via (nestad) end-point polymeraskedjereaktion (PCR), digital PCR (dPCR), clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated with protein-9 (CRISPR-Cas9)-systemet och Next-Generation Sequencing (NGS) har utvecklats och testats under forskningsförhållanden med samma allmänna detektionsstrategi, genom att rikta in sig på exon–exon-anslutningar hos mänskliga cDNA-sekvenser av EPO eller andra gen-dopingrelevanta gener (till exempel GH1, VEGF-A, FST och IGF-1). Gemensamt för de flesta av dessa tillvägagångssätt är dock antingen deras begränsade detektionspotential vad gäller antalet möjliga exon–exon-anslutningar per reaktion (exempelvis i fallet med qPCR och dPCR) eller deras kostsamma och tekniskt krävande tillämpning (i fallet med NGS). Därför eftersträvas mer omfattande och högpresterande testalternativ.

Definition av gendoping genom åren

Gendoping förbjöds första gången av WADA 2003, men har presenterats olika genom åren. Första gången det fanns en beskrivning i ord av begreppet gendoping var 2004: ”Gendoping eller cell-doping definieras som det icke-terapeutiska användandet av gener, genetiska element och/eller celler som har förmågan att förbättra idrottsprestationer.”

I WADAs förbjudna lista 2008 definierades gendoping som ”det icke-terapeutiska bruket celler, gener, genetiskt material och modulatorer av genuttryck och har kapaciteten att öka idrottsprestationerna är förbjudet.”

I WADA-listan 2009 är texten omskriven. ”Överföringen av celler eller genetiskt material eller användande av celler, genetiskt material eller farmakologiska substanser som modulerar uttrycket av endogena gener och har kapaciteten att öka idrottsprestationerna är förbjudet.”

I listan för 2010 står det under rubriken Gendoping. ”Det följande, med potentialen att öka idrottsprestationen, är förbjudet. Överföringen av celler eller genetiskt material (exempelvis DNA och RNA) och farmakologiska eller biologiska substanser som ändrar genuttrycket.”

I WADAs förbjudna lista för 2011 uttryckte man det annorlunda: ”Det följande, med potentialen att öka idrottsprestationen, är förbjudet. Användandet av nukleinsyror och analoger till nukleinsyror. Det är också förbjudet att använda normala och genmodifierade celler. Substanser som direkt eller indirekt påverkar funktioner som påverkar effekten genom att ändra uttrycket av gener är förbjudna. Exempel på det är Peroxisom Proliferator Aktiverad Receptor delta (PPAR-delta) agonister (till exempel GW 1516) och PPAR-delta AMP-aktiverat proteinkinase(AMPK) axelagonister (till exempel AICAR).”

I listan för 2012 var det ånyo förenklat. ”Det följande, med potentialen att öka idrottsprestationen, är förbjudet. Överföringen av nukleinsyror och sekvenser av nukleinsyror samt använda normala och genmodifierade celler.”

I listan för 2013 anges. ”Det följande, med potentialen att öka idrottsprestationen, är förbjudet. Överföringen av polymerer av nukleinsyror och nukleinsyreanaloger samt använda normala och genmodifierade celler.”

År 2013-2017 var skrivningen oförändrat.

2018 gjordes ett tillägg så att den totala lydelsen blev: ”Det följande, med potentialen att öka idrottsprestationen, är förbjudet. Överföringen av polymerer av nukleinsyror och nukleinsyreanaloger, användningen av substanser som är avsedda att redigera gensekvenser och/eller transkription eller epigenetisk reglering av genuttrycket samt använda normala och genmodifierade celler.”

2019 ändrades rubriken till “Gen- och celldoping” men ordalydelsen var i övrigt oförändrad jämfört med året innan.

2020 utvecklades texten något: ”Det följande, med potentialen att öka idrottsprestationen, är förbjudet. Användning av nukleinsyror och nukleinsyreanaloger som kan ändra gensekvenser och/eller genuttrycket på något sätt är förbjudet. Detta inkluderar, men är inte begränsat till, genredigering, inhibering av genaktivitet och gentransfererings. Dessutom är det förbjudet att använda normala och genmodifierade celler.”

I texten i 2021 års lista klargörs i översikten att Gen- och celldoping alltid är förbjudet, det vill säga både vid tävling och träning samt att alla metoderna i denna klassen hänförs till ”non-specified methods” utom under sektionen M2.2 som är ”specified methods.” I övrigt är texten oförändrad. Med M2.2 avses ”förbud att använda normala och genmodifierade celler.”

Texten 2022 och 2023 är identisk med texten 2021.

Gendopningens historia

Gendopning är överföring av gener till idrottsutövare, vilken ska förbättra någon del av den fysiska förmågan (på sikt kanske också den mentala kapaciteten) och därmed också den idrottsliga prestationen. I och med att genteknik är ett ungt forskningsområde har man bara misstankar om att denna form av dopning tillämpas av idrottsmän; det finns inga säkra bevis hittills. Det är användningen av genteknik inom sjukvården som skapat förutsättningar för gendopning. De metoder som används för att återställa en sjuk persons egenskaper är samtidigt en möjlighet att förbättra sin fysik för vältränade idrottare.

Den amerikanske muskelforskaren H. Lee Sweeney arbetade på University of Pennsylvania från och med 1989 och grundade Paul D. Wellstone Muscular Dystrophy Cooperative Research Center 2005. Han lämnade Penn och började på fakulteten vid University of Florida College of Medicine 2015, där han blev chef för det nya Myology Institute. 1998 publicerade hans laboratorium arbete där de använde genterapi för att införliva en extra kopia av IGF1 i muskelceller i låret hos unga och gamla möss; åldersrelaterat muskelåldrande hos de äldre mössen vändes och både gamla och möss blev starkare. Mössen blev kända som “Schwarzenegger-möss”. Sweeney började snart få samtal från idrottare och tränare som bad honom att använda denna metod för gendopning och anses vara den forskare som fick i gång diskussioner på allvar kring gendopning. Detta ämne var relativt nytt vid millennieskiftet, men experter är fortfarande osäkra om och när dopningsmetoden kommer att bli vanlig.

Mycket pengar har satsats på gendopningsforskning för att i framtiden kunna spåra infogade gener och få fast de fuskande idrottarna. Problemet är att det hittills verkar mycket svårt att avslöja de misstänkta. Vanliga dopningstester är inte tillräckliga utan man måste undersöka enskilda celler från de vävnader som misstänks ha blivit modifierade. Behandlingen är ganska lätt att utföra jämfört med andra dopningsmetoder och effekten varar samtidigt mycket längre. Detta kan ses som motivation för idrottare att pröva på den här nya typen av dopning.

Inom idrotten är uppbyggnad av muskelmassa samt ökning av mängden röda blodkroppar de två mest tänkbara metoderna för att förbättra prestationen genom gendopning. Inom idrotter där fysisk styrka krävs är den bästa metoden att öka tillväxten av muskelvävnad. Detta kan göras antingen genom att öka tillväxten av hormonet GH eller att inaktivera genen för myostatin, ett ämne som bromsar utvecklingen av muskler. Vid uthållighetsidrotter som löpning, skidåkning och cykling bör man få in gener som ökar EPO-produktionen, som i sin tur ökar produktion av röda blodkroppar som leder till bättre syreupptagningsförmåga.

Riskerna med att modifiera en människas genom är mycket stora. Man använder speciella virus för att föra in de utvalda generna i en människas cell. Virus har en särskild förmåga att tränga sig in i levande celler för att sedan avlasta sin genetiska information som är tänkt att masskopieras och spridas vidare. Innan viruset tillsätts byter man ut informationen mot de gener man vill ha in i cellerna. Det finns exempel på fall inom sjukvården där immunförsvaret överreagerat på det tomma viruset vilket lett till dödsfall. Ett annat scenario som inträffat är att viruset lett till cancer genom att störa gener som kontrollerar celldelning. Enligt insatta personer är det skillnad att ta en sådan risk som svårt sjuk och att göra det som frisk idrottsman. Därför anses det mindre legitimt med gendopning än med genterapi.

Gendopingsmöjligheter idag

Under de senaste åren har det gjorts betydande kliniska framsteg med överföring av genetiskt material (DNA/PNA) för att med denna genteknik – ”genterapi” – bota eller lindra vissa former av blodbrist (anemi), perifera kärlsjukdomar och muskelsjukdomar (muskeldystrofi). Det ligger då nära till hands att försöka använda liknande metoder för att läka skador, exempelvis muskelskador, och därifrån är inte steget långt till att försöka öka muskelprestationer genom tillförsel lokalt av specifika tillväxtfaktorer – det vill säga gendoping. Experimentellt är detta redan möjligt på försöksdjur med hjälp av tillväxtfaktorerna bFGF och NGF.

Om detta låter svårstoppat och pessimistiskt bör man inse att denna nya kunskap samtidigt öppnar upp för metoder om hur man skall avslöja gendoping.

I denna lettiska översiktsartikel över dagens kunskap görs det troligt att vi i första hand kommer att se gendoping genom att använda faktorerna:

erythropoietin (EPO)

vascular endothelial growth factor (VEGFA och VEGFD)

insulin-like growth factor 1 (IGF-1)

growth hormone (GH)

phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 (PCK1)

myostatin (MSTN) och MSTN antagonister som exempelvis follistatin (FST)

Mycket talar för att MSTN, IGF, GH och rhGH (recombinant human GH) kommer att vara viktiga för sprint och andra explosive sporter medan EPO (och rekombinant EPO), VEGFA, HIF-1, PPARD och PCK1 kommer att vara lockande att manipulera i uthållighetssporter.

2003 lade WADA till gendoping på den förbjudna listan och sedan 2013 (reviderat 2021) definieras gendoping som “the transfer of polymers of nucleic acids or nucleic acid analogues or the use of normal or genetically modified cells.”

Med den nobelprisbelönade gensaxen CRISPR/Cas kommer nu ytterligare möjligheter till sofistikerad gendoping. WADA gav mot denna bakgrund 2021 ut guidelinjer för hur man skall arbeta mot gendoping och påpekar där att den snabba utvecklingen inom fältet kräver att man använder ett flertal analytiska modeller och inte bara polymerase chain reaction (PCR).

Genterapi för ögon och öron: förhoppningar och utmaningar

I februari 2025 publicerade The Lancet en första-in-människa-studie av genterapi för barn med AIPL1-associerad retinal dystrofi, en sjukdom som orsakar allvarlig synnedsättning från födseln. De fyra barnen i studien uppvisade förbättrad funktionell syn utan allvarliga biverkningar. Den aktuella genen levereras via rekombinant adeno-associerat virus. Lovande resultat har också rapporterats för genterapi vid vissa former av medfödd dövhet.

Ögat och örat är särskilt väl lämpade för genterapi. De är kirurgiskt lättillgängliga för vektorleverans, vilket möjliggör lokal behandling med mindre mängd virusvektor, vilket minskar potentiella biverkningar och immunreaktioner. Effekterna av vektorleverans kan enkelt mätas, och eftersom näthinne- och hörselceller i stor utsträckning är icke-delande, kan den terapeutiska genen ha en långvarig effekt efter en engångsbehandling, vilket kan ge livslånga fördelar.

Den största utmaningen för dessa terapier är kostnad och tillgänglighet – voretigene neparvovec beräknas kosta 425 000 dollar per öga. I denna studie tillhandahölls genterapin under en särskild licens från Storbritanniens läkemedelsmyndighet och finansierades av välgörenhetsorganisationer och små vinstdrivande företag.

Denna typ av genterapi har naturligtvis inget med idrott och doping att göra, men den visar att gendoping är inom räckhåll och att antidopingorganisationer måste förhålla sig till det.

GENDOPINGENS FYSIOLOGISKA BAKGRUND

Det humana genomet som en bas för gendoping

Idrottsprestationen är komplex vad avser miljöfaktorer (mängd och typ av träning liksom sociala faktorer) liksom genetiska faktorer, där de sistnämnda år polygena – det vill säga att en rad genetiska faktorer fungera tillsammans i ett komplex samspel.

Den här aktuella sammanställningen redovisar de mänskliga generna (genomet), epigena faktorer (ärftliga faktorer som ligger utanför generna) samt proteomics och metablomics (effekt på proteinerna och ämnesomsättningen) och dessas effekter på prestationsförmågan. När man väl har kartlagt dessa effekter finns det också möjligheter att påverka dem med gendoping.

Det är emellertid inte bara prestationsförmågan som kan påverkas genom manipulation av generna utan också exempelvis idrottsutövarens skaderisk och läkningsförmågan efter skador.

Slutligen blir det naturligtvis till slut möjligt att med artificiell intelligens bearbeta genomet för den enskilda individen och på ett mycket säkrare sätt än idag förutsätta i vilka idrottsgrenar som en ung person kan bli framgångsrik med rätt träning. Det kanske inte låter helt önskvärt, men blir till slut trots allt realistiskt.

ENSKILDA GENERS BETYDELSE

Gener som samtidigt styr testosteronnivåer och muskeltillväxt

Forskningen har hittills hittat 822 delar av gener (single nucleotide polymorphisms, SNPs) som har visat sig vara med och bestämma nivån på testosteron i blodet. I den här presenterade studien har man testat dessa gener med avseende på muskelfiberstorlek, fettfri kroppsvikt och handgreppsstyrka (det bör dock understrykas att testosteronnivån i blodet bara kan förklara en del av testosteronets verkan på exempelvis idrottsutövare)

Man undersökte 148 fysiskt aktiva personer (47 kvinnor och 101 män) med avseende muskelfiberstorlek (cross-sectional area, CSA) av snabba muskelfibrer. Från en biobank med >354,000 personer kompletterades med data om SNP och fettfri kroppsvikt och handgreppsstyrka.

Av de 822 gendelarna kunde man identifiera fem (DOCK3 rs77031559 G, ESR1 rs190930099 G, GLIS3 rs34706136 TG, GRAMD1B rs850294 T, TRAIP rs62260729 C) som var samtidigt positivt associerade med testosteronnivåer i blodet och med muskelfiberstorlek, fettfri kroppsvikt och handgreppsstyrka.

Kunskapen kan användas för att bättre förstå träningseffekter av muskelträning, men också av doping samt kan användas både för doping och antidoping.

GENDOPING I PRAKTIKEN

Muskelgendoping på riktigt

I näst sista marsnumret 2023 av New England Journal of Medicin ägnas en artikel åt utvecklingen av genterapi för att behandla muskelsjukdomar (exempelvis den ärftliga och dödliga Duchennes muskeldystrofi där man vet exakt vilken gen som är muterad). Det finns nu resultat från flera hundra behandlingar där man har använt ”adenoassocierade virus (AAVs)” för att lämna botande gener till muskelcellerna.

Idag finns det mycket uppmuntrande resultat avseende barn och ungdomar där effekten till och med kan betecknas som botade. Samtidigt har man emellertid också erfarenheter av hur farlig behandlingen kan vara. Det beskrivs fyra dödsfall så sent som i december 2021 i en studie av genterapi i en sjukdom vid namn myotubulär myopati, där visserligen musklerna påverkats på ett positivt sätt men där levern samtidigt förstördes.

I de senaste lyckade försöken har man använt allt högre doser av vektor-virus och man har ansett att de behövts minst 1014 virus per kilo kroppsvikt. Nu har man inlett försök med mindre virusmängder och modifierade virus för att undvika leverskadorna, samtidigt som man har metoder för att få att virusen att i första hand ackumuleras just i muskelcellerna.

Andra biverkningar som påvisats av modifierade AAVs är aktivering av komplementsystemet och trombocyterna vilket ger risk för generaliserad blödningstendens.

Sammantaget finns det idag rapporter om att man kan ”gendopa” muskler vid bestämda ärftliga muskelsjukdomar hos människan, vilket gör det troligt att man också kommer att kunna använda liknande tekniker för att påverka friska muskler hos exempelvis idrotts-utövare. Men … den akuta risken är potentiellt livshotande biverkningar är hög och de kroniska effekterna är fullständigt okända.

Kommersiellt tillgänglig erytropoietin-gendoping

Gendopning har varit klassificerat som en förbjuden metod av WADA och International Olympic Committee (IOC) i över två årtionden. Trots att genterapeutiska metoder förbättras och samtidigt säkerhetsbekymren för kliniska tillämpningar minskar, fortsätter farhågorna om deras illegala användning inom elitidrott att växa. Två produkter tillgängliga via internet-baserade leverantörer och marknadsförda som innehållande erytropoietin och IGF1-gen analyserades för närvaron. I den aktuella undersökningen analyserades dessa två produkter från internetbaserade leverantörer för närvaron av potentiella gendopningsmedel med hjälp av en nyutvecklad multipel gen doping-testpanel. Två olika produkter (här benämnda EPO-P och IGF1-P), presenterade som nukleinsyrainnehållande formuleringar lämpliga för förbättring av idrottsprestationer, beställdes via en webbsida. EPO-P beskrevs som en plasmid som kodar för EPO-genen, medan IGF1-P skulle innehålla en plasmid med IGF1-genen. EPO-P beskrevs vidare som en syntetisk gen som, vid transkription, ger funktionell erytropoietin och ger lokala och systemiska effekter. CpG-motiv inom plasmiden skulle dessutom positivt stimulera kroppens immunsystem. Produkterna påstods vara “säkra” utan mutationseffekter på det mänskliga genomet. Båda produkterna avses injiceras intramusku-lärt med en koncentration av 0,04–2,85 mikrog/kg för IGF1-P eller 1 mikrog/kg för EPO-P var femte dag. IGF1-P påstods också vara lämplig för användning hos hästar.

Av detta skäl utvecklades en ny hög-multiplex gendopingpanel i samarbete med Agena Bioscience (San Diego, CA, USA) som möjliggör en multi-måldetektionsmetod med hjälp av matrix-assisterad tid-of-flight laser desorption/ionization (MALDI-TOF) masspektrometri (MS). Den nya metoden är baserad på en 20-plex PCR-amplifieringssteg och en efterföljande enbasförlängningsprocedur (SBE) med ett slutligt detektionssteg med användning av MALDI-TOF MS. Förlängningsprimrar för SBE-produktgenerering är placerade specifikt vid exon–exon-anslutningar hos relevanta transgena DNA-mål. Panelen omfattar primeranalyser för sju potentiella gendopingsmål (EPO, FST, GH1, MSTN (Propeptide), IGF1, VEGFA och VEGFD) med 2–3 detektionsanalyser per relevant måltranskript i en reaktion. För EPO-transgendetektion inkluderar panelen en detektionsanalys riktad mot exon(2)–exon(3)-anslutningen (EPO_1-analys) och en detektionsanalys mot exon(3)–exon(4)-anslutningen (EPO_2-analys). Eftersom flera protein-kodande transkript har rapporterats för den mänskliga IGF1-genen, ingår fyra analyser i panelen som täcker exon(3)–exon(4)-anslutningen (IGF1_1_1 och IGF1_1_2-analyser), exon(4)–exon(5)-anslutningen (IGF1_2-analys) och exon(4)–exon(6)-anslutningen (IGF1_3-analys).

Extrakt från båda produkterna visade sig innehålla transgen EPO-DNA, medan transgen DNA för IGF-1 inte detekterades. Resultaten bekräftades med SYBR Green qPCR med primer-set riktade mot EPO- och IGF1-cDNA samt CMV-promotorsekvensen.

Oligonukleotider för reglering av gener

Under de senaste två decennierna har Europeiska läkemedelsmyndigheten (EMA) och USA:s livsmedels- och läkemedelsmyndighet (FDA) godkänt flera genterapier. En kategori är oligonukleotidterapier, som möjliggör reglering av uttrycket av målgener. Förutom redan godkända terapier pågår flera prekliniska och kliniska studier. Ur ett regulatoriskt perspektiv har EMA kategoriserat genterapiprodukter som en undergrupp av “läkemedel för avancerad terapi” (ATMPs). Dessa produkter definieras vidare som ”biologiska produkter med en aktiv substans som innehåller en rekombinant nukleinsyra i syfte att reglera, reparera, ersätta, lägga till eller ta bort en genetisk sekvens, och som ska ha en terapeutisk, förebyggande eller diagnostisk effekt på patienten.” Vacciner ingår dock inte i denna kategori på grund av deras förebyggande effekt mot infektionssjukdomar. Genterapins tillämpningsområde är behandling av cancer eller sällsynta genetiska sjukdomar. De första genterapierna som godkändes av EMA respektive FDA under 2012 och 2017 var båda baserade på överföring av gener via adeno-associerade virus (AAV). Denna vektorbaserade introduktion av främmande deoxiribonukleinsyra (DNA) leder till uttryck av ett funktionellt protein in vivo. Till skillnad från denna princip har forskningen även fokuserat på andra metoder som syftar till att modulera uttrycket av kroppens egna gener eller genomredigering. Det senare bygger på CRISPR/CAS9-baserad redigering av genomet.

WADA förbjuder användningen av ”nukleinsyror och analoger till nukleinsyror som kan förändra genomsekvenser och/eller förändra genuttryck genom någon mekanism” som en icke specificerad metod. Därför skulle administrering av nukleinsyror eller dess analoger av idrottare innebära ett brott mot antidopingsreglerna. I denna översikt diskuteras typer av oligonukleotidterapier, deras potentiella missbruk inom idrotten samt aspekter av prov-beredning och masspektrometriska metoder i relation till antidopingsanalys.

Utvecklingen av så kallade oligonukleotidbaserade terapier möjliggör en mängd olika former av genreglering. Oligonukleotider är små syntetiska nukleinsyror, antingen enkel- eller dubbelsträngade, som verkar på sina mål genom Watson–Crick-basparning med komple-mentära ribonukleinsyra (RNA)- eller DNA-sekvenser.

Oligonukleotidterapier inkluderar antisensoligonukleotider (ASOs), små interfererande RNA (siRNA), mikroRNA (miRNA)-mimetika, små hårnåls-RNA (shRNA), budbärar-RNA (mRNA) och små aktiverande RNA (saRNA).

ASOs är korta enkelsträngade molekyler (13–30 nukleotider) som binder till ett komplemen-tärt RNA-mål. Beroende på deras verkningssätt kan de delas in i två grupper: genuttrycks-hämmare och splitsningsmodulatorer. Hämmning av målgener uppnås vanligtvis genom RNas H, som bryter ner mål-RNA:t i ASO–RNA-komplexet. Pre-mRNA-splitsning kan påverkas av ASO:s som antingen medierar exon-skipping eller exon-inkludering. Utöver detta kan ASOs också indirekt påverka uttrycket av en målgen genom att binda till miRNA och därigenom förhindra miRNA från att binda till mål-mRNA:t. Dessa ASOs kallas antagomiRs eller miRNA-hämmare.

För att minska snabb nedbrytning av endogena nukleaser har ASO:er modifierats i stor utsträckning. Dessa modifieringar omfattar förändringar av ryggraden (fosforotioater, PS; fosforodiamidat-morfolino-oligomerer, PMO), sockermodifieringar såsom 2′-O-metyl (2′-OMe), 2′-O-metoxi-etyl (2′-MOE), öppna ringformade sockerderivat eller 2′-fluoro (2′-F)-grupper, samt nukleotidbasmodifieringar som införande av 5-metylcytosin (5mC) eller konjugering med N-acetylgalaktosamin (GalNAc), vilket möjliggör leverriktad leverans.Vidare är dessa modifieringar fördelaktiga eftersom de minskar immunmodulerande effekter och eliminerar behovet av en extra bärare för leverans.

Förutom ASO:er är siRNA:er den näst vanligaste typen av oligonukleotidterapier. Ett siRNA är ett dubbelsträngat RNA som är mycket specifikt för ett visst mRNA. Genavstängning uppnås genom att en av siRNA-strängarna (guide-strängen) binder till Argonaute 2 (Ago2)-proteinet i RNA-induced silencing complex (RISC). Det aktiverade RISC-komplexet bryter ner mål-mRNA:t, som sekvensspecifikt känns igen och binds av siRNA:s guide-sträng. Ribosmodifieringar (2′OMe, 2′-F) och modifieringar av ryggraden används även för kemisk stabilisering, liknande som hos ASO:er. Dessutom är de flesta siRNA-terapier GalNAc-konjugerade för att rikta sig mot levern via underlättat cellulärt upptag i hepatocyter genom asialoglykoproteinreceptorn.

Till skillnad från siRNA:er kan ett miRNA-mimetikum modulera många mål och kan därför användas i behandlingar som riktar sig mot flera gener samtidigt. Mekanismerna för siRNA och miRNA-mimetika sammanfattas ofta som RNA-interferens. Hittills har dock inga miRNA-mimetikaterapier blivit godkända.

En annan möjlig verkningsmekanism är RNA-aktivering (RNAa) via saRNA:er. Endogent ökar dessa dubbelsträngade RNA (21 nukleotider) genuttrycket antingen reversibelt genom bindning till promotorregioner eller mer långsiktigt genom epigenetiska förändringar. Likt siRNA binder saRNA till Ago2 och bildar RNA-induced transcriptional activation complex (RITA) tillsammans med RNA-helikas A och ett RNA-polymerasassocierat protein. Även om inga saRNA-terapier ännu är godkända, finns ett växande intresse för denna mekanism, med kandidatterapier i preklinisk utveckling. Dessutom undersöks ett saRNA-läkemedel för behandling av levercancer i en fas II-studie.

mRNA är enkelsträngade RNA-molekyler som består av en öppen läsram (ORF), flankerad av en 5′ och en 3′ icke-translaterad region (UTR). I 5′-änden finns en modifierad guaninbas (den så kallade 5′-hatten), och i 3′-änden finns en sekvens med flera adenosiner (så kallad poly(A)-svans). mRNA-terapier har utvecklats för vaccination mot infektionssjukdomar, som proteinersättning eller för tumörimmunterapi.

På senare tid har även antikropp–oligonukleotid-konjugat (AOC:s) hamnat i fokus. Likt antikropp–läkemedelskonjugat kombinerar AOC:er antikroppars selektivitet för specifika målcellstyper med effektiviteten hos den kopplade nyttolasten. I nuvarande AOC:er består denna nyttolast av antingen siRNA eller ASO:er. Specifika aspekter av AOC:er har nyligen granskats av Dugal-Tessier med flera. På grund av lovande effekter i en aktuell klinisk prövning har FDA i USA beviljat “breakthrough therapy”-status för den första AOC:n, delpacibart etedesiran (del-desiran), under 2023. Det förväntas att fler AOC:er kommer att utvecklas inom en snar framtid.

I maj 2024 har totalt 16 oligonukleotidbaserade terapier godkänts av FDA och EMA; däribland 10 ASO:er, fem siRNA:er och en RNA-baserad aptamer. Flera andra utvärderas för närvarande i fas III-prövningar, och måste därför ses som kandidater för framtida godkännande. Bland dessa läkemedel riktar sig majoriteten mot levern (mipomersen, patisiran, inotersen, givosiran, volanesorsen, lumasiran, inclisiran och vutrisiran). Fyra av de 16 godkända oligonukleotidbaserade läkemedlen riktar sig mot muskelvävnad, två mot ögat (formivirsen och pegaptanib), och två mot centrala nervsystemet (nusinersen och tofersen).

Potentiellt dopingrelaterade terapeutiska mål

När det gäller potentiellt missbruk av idrottare kan mål relaterade till prestationshöjning eller påskyndad återhämtning vara av intresse. De årligen publicerade antidopingstatistiken visar att inte bara godkända läkemedel missbrukas för prestationshöjande syften. Därför inklu-derar vi här både godkända oligonukleotidterapier samt icke-godkända som hittills endast testats i prekliniska modeller men vars effekter skulle kunna vara intressanta som dopingmål i idrott.

För det första är det tänkbart att rikta in sig på det muskuloskeletala systemet genom att hämma muskelnedbrytning eller främja myoblastproliferation. Muskeldystrofi (MD) omfattar genetiska sjukdomar som orsakar muskelsvaghet och en progressiv förlust av muskelmassa. Bland alla kända muskeldystrofier har Duchennes muskeldystrofi (DMD) den högsta och Beckers muskeldystrofi (BMD) den näst högsta förekomsten i världen. De ansvariga mutationerna finns i dystrofingenen (DMD) som är X-kromosombunden och kodar för ett protein som är avgörande för muskelstyrka och stabilitet i muskelfibrer.

Förutom farmakologiska terapier såsom antiinflammatoriska eller antioxidativa behandlingar, eller behandlingar som syftar till att normalisera intracellulära Ca²⁺-nivåer, har antisens- och genterapeutiska metoder blivit föremål för forskning och utveckling. Den första studien som undersökte potentialen för en antisensbaserad metod att återställa funktionellt dystrofinuttryck i en MD-musmodell publicerades 2001.

För närvarande finns fem oligonukleotidterapier godkända för behandling av DMD (Exondys 51, Vyondys 53, Waylivra, Viltepso, Amondys) och en för spinal muskelatrofi (Spinraza), där samtliga sex är antisensoligonukleotider (ASO:er).

När det gäller potentiellt missbruk för prestationshöjning inom idrott verkar en administrering av dessa godkända oligonukleotidterapier för sällsynta sjukdomar vara osannolik, eftersom de endast är effektiva hos personer som bär på mutationer i dystrofingenen.

Det finns dock andra mål inom det muskuloskeletala systemet som kan vara av intresse. Det mest studerade är myostatin, en myokin som negativt reglerar muskeltillväxt. Genom att hämma uttrycket av myostatin med siRNA har en ökning i muskelfiberstorlek och muskel-massa visats i både möss och fisk. Dessutom har användningen av en okta-guanidin-morfolino-oligomer också inducerat ökad skelettmuskelmassa i både normala och kakexiska möss.

Nyligen har en ASO som riktar sig mot en splitsningsförstärkare i exon 1 av MSTN-genen beskrivits som en nyupptäckt myostatinhämmare. Även om endast prekliniska studier i gnagare eller fisk har utförts, finns det potential för oligonukleotidbaserade metoder att öka muskelmassa genom att rikta sig mot myostatin.

Vidare kan myostatinuttryck hämmas genom att rikta in sig på reglerande miRNA. Det har visats att en intramuskulär injektion av en plasmid som uttrycker miR-27a i möss signifikant ökade muskelfibrernas tvärsnittsarea.

Principiellt sett kan även delar av myostatinets signalväg vara möjliga mål för en oligo-nukleotidbaserad terapeutisk metod med målet att öka muskelmassa. Bland dessa mediatorer är transkriptionsfaktorn FoxO-1 avgörande för regleringen av skelettmuskelns differentiering, och dess hämning med en ASO i möss har kopplats till ökad muskelmassa.

Dessutom är myostatinbindande proteinet follistatin (Fst) av intresse, eftersom det blockerar myostatinets signalväg och därigenom också ökar skelettmuskelmassan. Baserat på detta är myostatinhämmare, inklusive Fst, förbjudna inom idrotten under kategori S4 (Figur 1). Förutom administrering av rekombinant Fst är det möjligt med genterapi riktad mot Fst för att öka det endogena uttrycket av proteinet. Även om en ökning av skelettmuskelmassa efter AAV-medierad genterapi med Fst har visats i prekliniska studier och kliniska prövningar på patienter med muskeldystrofi, finns det ännu inget godkänt läkemedel för genterapi med Fst.

Proteinet alfa-klotho (klotho), i sin membranbundna form, fungerar som en medreceptor för olika fibroblasttillväxtfaktorreceptorer (FGFR), och dess kluvna lösliga form verkar som ett proteohormon med olika funktioner. Sedan det först beskrevs har det kallats för ”långt-levnadsgenen” på grund av den förlängda livslängden hos möss med överuttryckt klotho. Klotho har även visats ha funktion inom muskler, då klotho-brist har kopplats till sarkopeni hos både möss och människor.

I motsats till detta har överuttryck av klotho – antingen i en transgen musmodell eller via AAV-leverans – ökat fysisk prestation hos möss samt ökat muskelstyrkan. Dessa effekter tros bero på klothos påverkan på muskelregeneration och muskelsatellitcellers funktion. Dess-utom har högre klothonivåer hos medelålders och äldre människor korrelerats positivt med muskelstyrka och negativt med skörhet. Baserat på dessa observationer är klotho ett intressant terapeutiskt mål, även om inga metoder ännu har testats i människa.

Ytterligare terapeutiska mål med potentiell relevans för doping inkluderar tillväxthormon (GH) och insulinliknande tillväxtfaktor 1 (IGF-1). Möjligheten att öka GH-nivåer har visats i möss med hjälp av ett icke-viralt, icke-integrerande liposombaserat vektorsystem, som efter en till två injektioner gav låg toxicitet och långvarigt förhöjda terapeutiska GH-serumnivåer. För närvarande finns inga tillgängliga data om möjliga försök på människor.

Förutom att leverera Igf-1-genen kan IGF-1-signaleringen även förstärkas genom att rikta in sig på IGF-bindande proteiner (IGFBP). Nyligen visades att IGF-1-signaleringen kunde förstärkas genom att med ASO sänka uttrycket av IGFBP-1 och IGFBP-3 i C2C12-celler. I kontrast till resultaten in vitro kunde dock inget exon skipping bevisas i en musmodell, vilket forskarna förklarar med dålig leverans av ASO:erna till målvävnaderna.

Dessutom kan lokal injektion av IGF-1 mRNA i skelettmuskulatur också vara ett alternativ för prestationshöjning. En nyligen genomförd studie visade på regenerativ potential hos IGF-1 mRNA med optimerade signalpeptider i en musmodell för muskelskada samt i en kanin-modell för ryggdiskbråck.

Mål relevanta för prestationshöjning inkluderar också de som är involverade i ökad uthållighet, hemoglobinnivå eller maximal syreupptagningsförmåga. Ett terapeutiskt läkemedel baserat på AAV-medierad leverans av erytropoietin-genen är Repoxygen®, som endast testats i prekliniska djurmodeller och vars utveckling avbröts 2003. Trots detta rapporterades det i samband med en rättsprocess om doping inom idrott redan 2006.

Det finns också ett aktivt patent på olika ASO:er för behandling av EPO-relaterade sjuk-domar, men ingen klinisk prövning har ännu inletts. Vidare är det möjligt att administrera EPO-mRNA, vilket har undersökts i studier på möss, råttor, grisar och apor, och därmed lett till ökat uttryck av EPO-protein och ökade blodcellnivåer.

Överuttryck av en exogent administrerad EPO-gen kan alltså resultera i prestationshöjande effekter. Det senaste fyndet av transgen EPO-DNA i två svarta marknadsprodukter märkta som material innehållande EPO- och IGF-1-gener för potentiell gendoping inom idrotten pekar på att icke-godkända genterapeutiska substanser finns tillgängliga.

Användning av icke-godkända produkter innebär emellertid alltid en betydande hälsorisk för användarna. Eftersom tillgången till oligonukleotidterapier kan vara begränsad på grund av höga kostnader eller avsaknad av godkännande, kan den svarta marknaden bli en potentiell källa. Preparat som finns tillgängliga där kan dock vara felmärkta, kontaminerade eller innehålla orenheter – precis som redan visats med illegala produkter som används för prestationshöjning och som exempelvis innehåller anabola androgena steroider eller tillväxthormonfrisättande peptider.

Gendopning på 3D-genomnivå

Med utvecklingen av genredigeringsteknologi har många genetiska sjukdomar kunnat behandlas effektivt, men samma teknik har också möjliggjort dopning i form av gendopning, vilket utgör ett potentiellt hot mot idrotten. WADA har uttryckligen inkluderat gendopning i sin förbudslista som en förbjuden metod (M3) och godkänt qPCR för att upptäcka detta. Gendopning kan dock lätt undvika upptäckt, särskilt om reglerande element uppströms om målgenerna beaktas, vilket gör uppgiften mer utmanande.

Hi-C-experiment baserade på 3D-genomteknologi, genom perspektiv som topologiskt associerande domäner (TAD) och kromatinloopar, ger en mer omfattande och djupgående förståelse av genreglering och genuttryck, vilket därmed bidrar till att bättre förebygga potentiell användning av gendopning på 3D-genomnivå. I detta arbete kommer vi att undersöka gendopning ur ett nytt perspektiv genom att analysera aktuella studier om gendopning och utforska relaterade gener i 3D-genomet.

GENDOPINGETIK

Kunskap om genernas betydelse för idrottsprestationen löser inte etikproblem

Finns det genetiska faktorer som möjliggör förbättrad idrottsprestation? Självklart gör det det, frågan är nästan trivial – den som vill bli olympisk mästare, bör ha bra gener från sina föräldrar i flera olika avseenden och förmodligen bra gener från flera generationer tillbaka. Utöver dessa många gener för tillväxt, muskelfunktion och kardiopulmonär funktion finns det vissa individuella gener som tydligt påverkar idrottsprestation och möjliggör exceptionell funktion.

Från det förflutna har idrottare som Wilt Chamberlain (218 cm lång) presterat exceptionellt som basketspelare och Willie Shoemaker (150 cm, 50 kg) som jockey. Deras genetiska sammansättning var ganska olika, men vid extremiteterna av det fysiologiska intervallet för längd. Dessa skillnader berodde utan tvekan på de individuellt små bidragen från hundratals gener. De tränade exceptionellt hårt och tilläts tävla på högsta nivå. För dessa och många andra idrottare är det troligt att dessa genetiska variationer hade en betydande roll i deras val av idrott.

Avseende enskilda gener finns många exempel som erbjuder en idrottsfördel, och det är lätt att välja några som visar omfånget av effekt. Exempel inkluderar genuttrycken erytropoietin-receptorn (EPOR), androgenreceptorn (AR), fullständig androgeninsensitivitet (CAIS), samt vissa genetiskt betingade hormonella överskott och brister (viriliserande binjurehyperplasi och genetisk tillväxthormonbrist, samt förmodligen myostatinbrist).

Eero Mäntyranta var en finsk längdskidåkare med flera olympiska guldmedaljer. Inte bara vann han en serie guldmedaljer, men han avslutade också minuter före sina närmaste konkurrenter i långdistanslopp – oerhörda tidsskillnader jämfört med tidigare tävlingar. Han vann genom en kombination av ihärdig träning och tävlings- och träningsvilja, men också eftersom hans hemoglobinkoncentration var upp till 65 procent högre än genomsnitts-mannen. Hans höga hematokrit förelåg utan de betydande problemen med reologi som har uppstått hos vissa cyklister som missbrukade erytropoietin eller fick autologt blod. Mäntyranta och hans familj har en enda basparmutation i EPOR-genen som gjorde att hans benmärg fortsatte längre att tillverka erytrocytföregångare som mognar till syretranspor-terande röda blodkroppar. Borde denna genetiska mutation utesluta Mäntyranta från tävling? När han tävlade kände man inte till mutationen och om man känt till den idag skulle det knappast finnas någon majoritet för att förhindra hans tävlingsdeltagande.

En andra intressant gen kodar för myostatin, ett protein som sätter en broms på muskeltill-växten. Homozygot borttagande av denna gen är väl beskrivet hos belgiska blåa nötkreatur, som är överdrivet väl muskelutvecklade (”dubbelt musklade”) med en motsvarande minskning av kroppsfett. Den mänskliga homologen till denna gen är välkänd med en enda individ med en mutation i denna gen rapporterad. Han hade stora muskler redan vid födseln och har fortsatt att växa (åtminstone upp till 4 års ålder) som ett barn “Hercules” med motsvarande styrka. Genmutationen i myostatingenen med mycket låga myostatinnivåer är homozygot och ansvarig för fenotypen. Det är för tidigt att definiera idrottsprestation hos den här pojken. Intressant nog var hans heterozygota mor (och heterozygota whippet-hundar - avlad omedvetet för hastighet) en professionell sprinter.

Ett annan idrottsintressant tillstånd är familjär partiell lipodystrofi, Dunnigan-varianten. De flesta kvinnor med denna genvariant har fettförlust från extremiteterna, buken och thorax med överdriven subkutan fett i ansikts- och supraclavikulära områden. Det är emellertid också förknippat med ökad muskelmassa som föreligger samtidigt med förlust av subkutant fett. Många av de drabbade har insulinresistens, hirsutism och menstruationsstörningar. Det finns flera genetiska varianter som sannolikt påverkar LMNA-genen, som kodar för nukleära lamininer.

En fjärde intressant gen är den som kodar för AR. De som saknar all funktion av denna gen ser vid födseln ut som normala kvinnor, men har endast den yttre tredjedelen av en “vagina” eftersom den härstammar från icke-Müllerska strukturer. Resten av den kvinnliga reproduk-tionskanalen saknas, eftersom 46,XY-kvinnor har testiklar som har producerat anti-Müllerskt hormon som är ansvarigt för försvinnandet av livmodern, äggledarna och den inre två tredjedelarna av vagina. Unga tonåringar med detta tillstånd ser helt normalt kvinnliga ut med bröstutveckling men har ingen kroppsbehåring och lider främst av amenorré. Även om testosteronnivåerna ofta är långt över det övre normalvärdet för vuxna män, finns det inga testosteroneffekter. Tvärtom är denna testosteronreservoar en föregångare till aromatas-enzymet och leder till betydande östrogennivåer (framför allt östradiol). Fenotypen med avseende på kroppsbyggnad (gynekoid) och normal bröstutveckling är helt kvinnlig förutom det reproduktiva systemet, inklusive könsbehåring. Under det tidigare testparadigmet för att tillåta idrottaren att tävla som kvinna hade dessa kvinnor ingen Barr-kropp (andra X-kromosomen), hade 46,XY karyotyp och SRY (testis-determinerande gen). Klart är att de med CAIS inte har någon idrottsfördel från de mycket höga testosteronnivåerna, även om de troligen är längre än genomsnittet för 46,XX kvinnor på grund av vissa höjd-determinerande gener på Y-kromosomen och kanske några som ökar mager kroppsmassa. Mutation av denna gen hittas hos färre än 1 av 20 000 i den allmänna befolkningen men är relativt vanlig bland elitkvinnliga idrottare – noterad som 1/421 och 1/423 vid de olympiska spelen i Atlanta 1996.

De mer djupgående svårigheterna uppstår hos de med partiellt androgenresistenssyndrom - ett spektrum från helt kvinnlig fenotyp (som vid CAIS) till nästan helt manlig. Alla har 46,XY karyotyp samt de med enzymbrister, vanligtvis längs steroidhormonvägen till kortisol, av vilka några påverkar äggstockar och testiklar. Det är dessa senare tillstånd som leder till höga nivåer av endogent testosteron (och andra androgener) och den svåra diskussionen om vem som tillåts tävla som kvinna (se ovan för en mer ingående historia om evolutionen av testning för vem som bör tillåtas tävla som kvinna). Även den senaste regeländringen – att testosteron-nivåerna måste vara under det lägsta för män – upprätthålls nu i avvaktan på data som visar att det är dessa nivåer i sig som “fullständigt” förklarar skillnaderna i idrottsprestation mellan män och kvinnor och en “glidande” skala som förutsäger bättre prestation hos de kvinnor med höga testosteronnivåer och androgenkänslighet. Som noterats flera gånger ovan bör dessa frågor inte förväxlas med dopning med androgena medel.

5-alfa reduktasgenen är en annan som kan muteras och leda till en störning av könsu-tvecklingen. Sådana 46,XY-individer kommer att ha låga nivåer av dihydrotestosteron och kan vara så underviriliserade att de tydligt uppfostras som kvinnor. Fyra idrottare från utvecklingsländer presenteras i en rapport som noterade deras diagnostiska procedurer och avslutades med gonadektomi så att de kunde tävla. Frågor om rättvisa, medicinsk etik och fullständigt informerat samtycke löstes inte.

Men … all den kunskap är inbjudan för de som tänker sig att syssla med gendoping.

Förutsättningar för gendoping med ny teknik (CRISPR) enligt SMER

CRISPR-tekniken som utvecklades i början av 2010-talet har radikalt förändrat möjligheterna för gendoping. Tekniken bygger på att ett protein (Cas) klipper av DNA-molekylens båda strängar på ett specifikt ställe som anges av en RNA-molekyl som är kopplad till Cas-proteinet. Därefter utnyttjas cellens egen förmåga att reparera skadat DNA för att åstadkomma en förändrad DNA-sekvens. Genom att byta ut en RNA-molekyl mot en annan går det enkelt att programmera var i arvsmassan förändringen ska ske. Tekniken har inte endast gjort det enklare och snabbare att förändra enskilda gener utan gör det också möjligt att genomföra förändringar i flera olika gener i samma cell, antingen samtidigt eller efter varandra, samt förändringar på kromosomnivå.

En teknisk svårighet vid genredigering med CRISPR-teknik är att undvika att det sker andra förändringar i arvsmassan än de avsedda och därmed riskera att introducera nya skadliga mutationer. Icke avsedda förändringar omfattar både ”felaktiga” förändringar på ”rätt” plats i arvsmassan och förändringar på andra ställen i arvsmassan än den plats som man vill förändra. Riskerna för oönskade förändringar är särskilt stora om flera gener ändras samtidigt.

En annan svårighet är att kunna förutsäga effekterna av de förändringar man vill göra för att vara säker på att de positiva effekterna överväger de negativa. Detta beror på att gener kan påverka organismen på många olika sätt. Genredigering kräver därför god kunskap om vilka olika effekter i kroppen en gen har och hur den samverkar med andra gener och med icke-genetiska faktorer. Denna kunskap är i nuläget begränsad, vilket kan utgöra en minst lika viktig begränsning för möjligheten till bred tillämpning av genredigering som de tekniska svårigheterna.

Även om fokus i dag ligger på behandling och prevention av sjukdom har de tekniska framsteg som skett också aktualiserat möjligheten att använda somatisk genredigering för tillämpningar utan medicinskt syfte, såsom att påverka fysiska egenskaper, psykiska egenskaper eller personlighetsdrag – varav gendoping är ett exempel. Eftersom de tekniska och kunskapsmässiga svårigheterna kan vara större samtidigt som nyttan generellt är mindre bedöms studier på människa av sådana ingrepp i dag inte uppvisa en acceptabel balans mellan förväntad nytta och risk.

Möjligheten att metoder som utvecklas för medicinskt syfte kan komma att användas även för att förbättra egenskaper gör att risker av detta slag behöver uppmärksammas i ett tidigt skede, redan när nya metoder utvecklas.

Genomisk övervakning för att skydda idrotten i post-CRISPR-eran

Idag är det tekniskt fullt möjligt att genom genteknik karlägga alla gener hos exempelvis de främsta elitidrottare för att bland annat försöka få reda på vad som är orsaken till att de presterar extraordinärt. Det är säkert ingen enstaka gen som orsakar detta och därmed inget lätt arbete. Dock är det troligt att man med statistiska metoder och många elitidrottares gener kan komma närmre.

Personlig genomik och genredigering väcker då också möjligheten till oupptäckbar gendopning. Sekvensering av idrottares genom kan då integreras i det biologiska idrottarpasset (Athlete Biological Passport) för att avskräcka framtida missbruk. Denna provokativa vision kräver en skyndsam debatt om rättvisa inom idrotten och om nya lösningar för att dela genomiska data samtidigt som den personliga integriteten bevaras.

Om fullständig kartläggning av elitidrottarnas gener skall vara en förutsättning för att få tävla i de stora mästerskapen förloras all integritet. Dessutom skapas en plattform för att skapa supermänniskor.

Vill vi det? Tanken svindlar.

GENETISK IDENTIFIERING

Mitokondrie-DNA (mtDNA) kan avgöra om ett dopingprov är utbytt

Dopingsbrott innefattar manipulation av prov, exempelvis utbyte av prov. Därför har det rekommenderats att korta tandemupprepningar (STR) används för att avgöra om dopingskontrollprover kommer från en och samma idrottare. Det har dock erkänts att det kan vara svårt att erhålla en fullständig STR-analys från obetydliga mängder DNA.

Mitokondrie-DNA (mtDNA) kännetecknas av sin stabilitet och höga cellulära kopienummer. Därför förväntas mtDNA-testning i urin kunna användas för att analysera prover som inte kan analyseras med STR-analys. Syftet med denna studie var att jämföra mtDNA-testning med STR-analys genom att genomföra känslighets-, överensstämmelse- (helblod, torkad blodfläck och urin) och fallstudier.

I känslighetsstudier visade mtDNA-testning högre känslighet jämfört med STR-analys. Överensstämmelsestudier visade att alla prover var konsekventa med mtDNA-sekvenserna och STR-profilerna. Allelisk dropout förekom i vissa urinprover vid STR-analys. Fallstudier visade att mtDNA-testning kunde användas för att erhålla DNA-profiler från samtliga testade prover, inklusive blod, torkade blodfläckar, urin, blodrester på nålar och blodfläckar.

Sammanfattningsvis är mtDNA-testning värdefull för att analysera kraftigt nedbrutna DNA-prover, såsom urinprover, i jämförelse med STR-analys. Urinanalys bör genomföras som en initial testprocedur eftersom mtDNA ärvs maternellt. I situationer där ett DNA-matchresultat är ogynnsamt för idrottaren kan ytterligare blodbaserad STR-analys krävas.

Genetisk identifiering genom DNA-bestämning på Dried Urine Spot (DUS)

Insamling av bloddroppar – och egentligen också andra flytande biologiska material – på läskpappaer (Dried Blood Spots, DPS, eller Dried Matrix Spots, DMS) för dopinganalyser är en metod på stark frammarsch. Molekylernas stabilitet efter insamling och lättheten av att transportera och förvara är signifikanta fördelar för metoden.

Ett ytterligare sätt att använda metoden diskuteras nu avseende dopingkontroller då metoden kan användas vid misstanke om att dopingprov manipuleras. Man kan nämligen fastställa en genetisk profil av den som lämnat ett urinprov, dried urine spot, DUS, genom analys av det material som finns samlat i läskpappret.

Man undersökte nu i en undersökning hur DNA i DUS påverkades av könstillhörighet, hur provet förvarades och hur länge provet sparades. Man tog prov på fem män och fem kvinnor och analyserade proverna upptill oh med 12 veckor. Man gjorde direkt-PCR på två-millimeterpappersbitar.

Resultatet visade att metoden fungerade utmärkt under alla de 12 veckorna och urinproverna kunde genetiskt identifiera varje individ hela tiden.

Vid misstanke om manipulering av urinprov i dopingtestningssammahang fungerar således metoden utmärkt.

RNA i Dried Blood Spots kan identifiera vem som lämnat dopingprov

Även om det biologiska passet för idrottare (Athlete Biological Passport, ABP) fungerar som en indirekt metod för att upptäcka erytropoietiin, krävs fortlöpande förbättringar för att öka dess känslighet och tillförlitlighet. Biomarkörer relaterade till järnmetabolism och erytropoes, som kompletterande parametrar till hematologimodulen i ABP, har potential att förbättra dess förmåga att indirekt upptäcka erytropoietin.

I denna studie extraherades RNA från torkade blodfläckar (dried blood spot, DBS) som samlats in under en period av 28 dagar (dag 0, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 21 och 28) efter administrering av terapeutiska doser av rekombinant humant EPO (Yibiao, 50 IE/kg per dos, administrerat subkutant två gånger). Uttrycket av fyra gener – mitoferrin 1 (MFRN1), ferrokelatas (FECH), ferroportin (FPN) och ferritinets tunga kedja (FTH) – analyserades.

Resultaten visade signifikanta förändringar i genuttryck, där MFRN1 uppvisade en maximal ökning på 2,43 gånger, med detektionsfönster som sträckte sig bortom dag 9. Detta gav högre känslighet och längre detektionsmöjlighet än traditionella ABP-parametrar. Integreringen av MFRN1 i ABP-ramverket har potential att öka upptäckten av EPO-missbruk hos idrottare.

LABORATORIETEKNIK

Analysmetoder för att upptäcka gendoping

Gendoping syftar till användningen av genetiska ingenjörstekniker för att förbättra idrottsprestationer. Det finns flera metoder och typer av gendoping, var och en med sina egna fördelar och nackdelar:

Genterapi som innebär införandet av en frisk kopia av en gen i en persons celler för att korrigera en genetisk defekt eller förstärka en specifik egenskap. Det kan utföras med hjälp av ett virus som har modifierats för att bära den önskade genen. Genterapi har använts på människor för att behandla vissa genetiska sjukdomar, som cystisk fibros och muskeldystrofi

Epigenetisk modifiering innebär att man ändrar hur gener uttrycks utan att ändra den faktiska DNA-sekvensen. Detta görs till exempel genom att modifiera kemiska taggar (som metylgrupper) som är fästa vid DNA vilket gör det möjligt att slå på eller av gener, vilket i sin tur kan påverka idrottsprestationer

Genredigering innebär att man använder molekylära verktyg som CRISPR/Cas9 för att exakt redigering av DNA-sekvensen hos en organism. Genredigering kan användas för att förbättra idrottsprestationer genom att införa fördelaktiga mutationer eller ta bort skadliga

Genöverföring innebär överföring av gener från en organism till en annan. Till exempel, genom att överföra gener för ökad muskeltillväxt från en tjur till en människa, kan det vara möjligt att förbättra idrottsprestationer. Det finns flera etiska och säkerhetsmässiga bekymmer förknippade med genetisk doping, vilket har lett till att många idrottsorganisationer förbjudit dess användning. Emellertid utvecklas tekniken ständigt och det är viktigt för reglerande organ att hålla sig uppdaterade om framsteg inom detta område för att förhindra missbruk

Målen för gendoping är de gener som reglerar idrottsprestationer eller fysiskt utseende. Dessa inkluderar i första hand gener som kontrollerar muskeltillväxt, syremetabolism och uthållighet. Genetisk doping syftar till att införa eller modifiera dessa målgener för att förbättra idrottsprestationer utöver normala gränser.

Designen av olika analysmetoder för genetiska dopingsexperiment innebär att man väljer lämpliga genetiska markörer eller sekvenser för att identifiera närvaron eller frånvaron av den modifierade genen. Till exempel, om målet är att införa en gen för ökad muskeltillväxt, kan metodn innebära att identifiera förändringar i genuttrycksnivåerna för markörer som myostatin eller follistatin. Metoden kan också innebära att sekvensera genomet eller undersöka strukturen hos den modifierade genen för att säkerställa att den har satts in korrekt.

Att få stabila resultat från gendopingsexperiment kan vara utmanande eftersom det kräver noggrann mätning av förändringar i en organisms fysiologiska eller fysiska egenskaper. Detta involverar ofta komplexa tester och testprotokoll som muskelbiopsier, syreupptagnings-mätningar eller tester av fysisk prestation. Resultaten kan också behöva utvärderas över tid för att bedöma hållbarheten av genmodifieringen.

Det är viktigt att notera att gendoping för närvarande är förbjuden av de flesta idrottsorgani-sationer på grund av säkerhets- och etiska överväganden. Även om framsteg inom genredigering och implementeringsstekniker kan erbjuda potentiella fördelar i framtiden, måste de övervakas av reglerande organ och användas ansvarsfullt för att säkerställa idrottarnas säkerhet och välbefinnande. Ett särskilt problem är att gendoping kan ge oåterkalleliga konsekvenser för dem som ägnar sig åt det, vilket innebär vid misslyckad gendoping – och kanske även vid initialt lyckad sådan – kan idrottsutövaren tillfogas skador som aldrig gåt att reversera.

Generellt sett kan metoder för upptäckt av genetisk dopning delas in i två kategorier: direkta metoder och indirekta metoder. Den direkta metoden liknar den konventionella metoden för att upptäcka drogdopning och bygger på direkt upptäckt av förbjudna ämnen eller deras metaboliter i fysiologiska prover. De indirekta metoderna syftar till att mäta eller övervaka kroppsreaktioner orsakade av överföringen och uttrycket av transgenerna eller genetiska dopningsmedel. När den detekterade genetiska dopningen är identisk med endogena expressionsprodukter eller vissa ämnen som snabbt kan metaboliseras, kan den indirekta upptäckningsmetoden vara ett bra val. Flera faktorer som ålder, kön, etnisk bakgrund och till och med naturliga virusinfektionsframkallade immunreaktioner kan emellertid komplicera tolkningen av resultaten eller öka risken för falskt positiva resultat. Därför är direkta metoder fortfarande ett populärt val för att utveckla olika effektiva metoder för upptäckt av gendopning.

PCR-metoder

Till skillnad från det inneboende genetiska materialet använder genmanipulation normalt cDNA; därmed kan deras exon/exon-förbindelser vara unika målområden för att särskilja dem från de relevanta intrinsiska generna. PCR-detektionstekniken, som är guldstandarden för genanalys, har studerats omfattande på grund av dess höga noggrannhet och reproducerbarhet. Inte förvånande har den använts flitigt inom området för upptäckt av genmanipulation under de senaste åren. WADA har också utfärdat riktlinjer för användningen av PCR-teknik vid upptäckt av genmanipulation. En av punkterna i riktlinjerna rekommen-derar användning av helblod som prov från vilket DNA extraheras och som kan användas som mall för transgendetektion med kvantitativ PCR med målspecifika primrar och hydrolys-prob. Hittills har flera kvantitativa PCR-baserade tekniker för upptäckt av genmanipulation rapporterats för användning i kontrollanalys av genmanipulation. Sådana metoder inkluderar användning av olika startmaterial (till exempel helblod, plasma och urin) och olika PCR-system (till exempel realtids-PCR och digital PCR).

Utvecklingen av dessa metoder har lett till att PCR-tekniken gradvis har blivit en noggrann och trovärdig metod för att detektera genmanipulation. Ingen av dessa metoder har dock implementerats i ackrediterade antidopningslaboratorier på grund av bristande validering. Dessutom innebär de flesta av dessa protokoll flera steg, vilket ökar risken för kontaminering och kräver betydande erfarenhet, tid och dyra utrustningsfaciliteter. Därför skulle nya metoder som innebär enklare och snabbare provmanipulering vara intressanta alternativ till dessa utvecklade protokoll. Det är värt att nämna att PCR-metoder etablerade med SYBR-fluorescerande färger som signalprober inte är tillämpliga när det gäller detektion av genmanipulation i verkliga prover. Anledningen är att denna metod använder en fluorfärg som inte är specifik för att känna igen dubbelsträngat DNA, inte känner igen specifika dubbelsträngar och är mycket mottaglig för falskt positiva resultat vid analys av biologiska prover.

Den framtida utvecklingsriktningen för PCR-baserade metoder inom dopningsdetektion kan sammanfattas på följande sätt:

Förbättrad Känslighet. PCR-metoder kommer att fortsätta utvecklas för att öka deras känslighet för att kunna detektera extremt låga nivåer av dopningsmedel. Detta kommer att innebära utveckling av effektivare amplifikationstekniker och avancerade detektionsteknologier

Multiplexförmåga. Det finns en växande efterfrågan på samtidig detektion av flera dopningsmedel i en enda analys. Framtida utveckling kommer att fokusera på att förbättra PCR-metoders multiplexförmåga, vilket möjliggör detektion av flera målgener eller molekyler i en enda reaktion

Snabbtestning. Ansträngningar kommer att göras för att minska den tid som krävs för dopningsdetektion med PCR-metoder. Detta innebär optimering av protokoll, förenkling av steg för provberedning och införande av snabbare amplifikations- och detektionsteknologier

Biomarkörer. Forskning kommer att fortsätta identifiera nya och specifika biomarkörer som kan fungera som indikatorer på dopning. PCR-metoder kommer att spela en avgörande roll för att amplifiera och detektera dessa biomarkörer, vilket underlättar deras validering och införlivande i dopningsdetektionsprotokoll

Icke-invasiv provtagning. Icke-invasiva provtagningsmetoder, som saliv- eller urintestning, blir alltmer populära inom dopningskontroll. Utvecklingen av PCR-baserade metoder som kan amplifiera och detektera dopningsbiomarkörer från icke-invasiva prover kommer att vara ett fokusområde för framtida utveckling

Integration med andra teknologier. PCR-metoder kommer att integreras med andra avancerade teknologier, såsom mikrofluidik, nanoteknologi och höggenomströmnings-systematik, för att ytterligare förbättra prestanda och förmågor för dopningsdetektion. Denna integration möjliggör förbättrad känslighet, ökad genomströmning och minskade krav på provvolym

Standardisering och Kvalitetssäkring. Standardisering av PCR-baserade metoder för dopningsdetektion är avgörande för att säkerställa pålitliga och konsistenta resultat. Ansträngningar kommer att göras för att etablera internationella standarder, riktlinjer och kvalitetssäkringsprogram för att säkerställa noggrannhet och reproducerbarhet av PCR-baserade dopningstester. Dessa framtida utvecklingar inom PCR-metoder syftar till att förbättra effektiviteten, effektiviteten och tillförlitligheten av dopningsdetektion, vilket i slutändan bidrar till att upprätthålla rättvisa spel och integritet inom idrotten.

Sekvenseringsbaserade metoder

I motsats till konventionella PCR-metoder är loop-medierad isoterm amplifikation (LAMP) en ny metod som kan amplifiera nukleinsyror med hög specificitet, effektivitet och snabbhet under isotermiska förhållanden. LAMP-tekniken erbjuder flera fördelar jämfört med traditionella PCR-baserade metoder, inklusive förenklade reaktionsförhållanden och en snabbare amplifikationsprocess. Vanligtvis utförs LAMP vid en konstant temperatur (60–65 °C) och kan uppnå en 109-faldig amplifikation inom 1 timme. Även om logistiken för LAMP är mycket enklare än för PCR är amplifikationsprincipen mer komplex. En nyckel till den underliggande amplifikationsschemat är användningen av primrar som genererar foldback-strukturer och deras efterföljande förlängningar av en DNA-polymeras som förflyttar en DNA-sträng. Med hjälp av DNA-polymerasamplifikation kan kaskadförstärkning av målgenens sekvens slutföras, och detektering av genmanipulation kan realiseras. Dess enkelhet, höga specificitet och robusthet gör det till ett attraktivt alternativ för detektion av nukleinsyror i resursbegränsade miljöer. Baserat på korrekt design av primrar för att utlösa LAMP-reaktionen med hög specificitet och effektivitet kan denna metod användas för enkel, snabb och selektiv detektion av genmanipulation med blotta ögat.

Förutom LAMP och PCR-baserade metoder som riktar sig till en exon/exon-sekvens i intronlösa transgener, erbjuder nästa generations sekvensering (NGS)-baserade analyser högre genomströmning och täcker ett större antal potentiella områden för genmanipulation. Det möjliggör snabb och samtidig sekvensering av miljontals DNA-fragment, vilket ger detaljerad information om den genetiska sammansättningen hos en individ eller ett prov. Inom genetisk detektion spelar NGS en avgörande roll för att identifiera, karakterisera och förstå de genetiska variationer som är förknippade med olika sjukdomar och tillstånd. Den ger en omfattande översikt över hela genomet, fångar både kodande och icke-kodande regioner, vilket underlättar identifieringen av sjukdomsorsakande mutationer, strukturella varianter och genuttrycksmönster.

Dessutom är helgenomresekvensering (WGR) en teknik inom genomik som används för att få hela DNA-sekvensen av en individs genom. Det innebär att jämföra individens DNA-sekvens med en referensgenom för att identifiera skillnader, inklusive enstaka nukleotid-polymorfismer (SNP), insättningar, borttagningar och strukturella variationer. NGS och WGR är båda kraftfulla tekniker inom genforskning för att analysera DNA-sekvenser. Det finns några skillnader mellan dem. NGS avser en uppsättning höggenomströmningssöknings-metoder som möjliggör parallell sekvensering av miljontals DNA-fragment. Den innebär fragmentering av DNA-provet i mindre bitar, fästande av adaptrar på dessa fragment och deras förstärkning genom flera cykler av sekvensering. WGR avser processen att sekvensera hela genomet hos en organism, inklusive både kodande och icke-kodande regioner, för att identifiera genetiska variationer jämfört med en referensgenom. I WGR sekvenseras individens eller en populations DNA antingen de novo eller jämförs med en känd referensgenom. Fördelarna med WGR för SNP-analys inkluderar främst en omfattande täckning- WGR möjliggör en omfattande analys av hela genomet och ger en övergripande bild av alla potentiella SNP som finns. Dessutom upptäckts sällsynta och nya varianter. Genom att sekvensera hela genomet gör WGR det möjligt att identifiera sällsynta och nya SNP som kanske inte fångas upp med andra metoder. Användningen av olika felkorrigeringsalgoritmer under datahantering hjälper till att minimera sekvenseringsfel, vilket resulterar i mer tillförlitlig SNP-uppringning.

Det är värt att notera att olika DNA-enzymer också kan användas för att detektera gen-manipulation och kan användas som ersättning för den komplicerade PCR-detektions-metoden. Senaste framsteg inom DNA-enzymer teknologi erbjuder ett lovande alternativ för att upptäcka genmanipulation. DNA-enzymer, även kända som DNAzymer eller katalytiskt DNA, är syntetiska enkelsträngade DNA-molekyler med enzymatisk aktivitet. Till exempel polymeraser, som kan katalysera syntesen av polymerer, specifikt nukleinsyror som DNA eller RNA. De används brett inom PCR-baserad detektion och DNA-sekvensering (såsom Sanger-sekvensering och nästa generations sekvensering (NGS)). Dessa tekniker använder DNA-polymeras för att inkorporera modifierade nukleotider, vilket avslutar DNA-syntes-reaktionen vid specifika positioner. Genom att analysera avslutningsmönstret kan sekvensen av det ursprungliga DNA:t, som kan spjälka fosfodiesterbindningar inom en DNA- eller RNA-molekyl, bestämmas som endonukleaser. De används brett inom olika tillämpningar som innefattar analys och detektion av DNA och RNA. De kan känna igen specifika DNA-sekvenser och skära DNA:t vid eller nära dessa sekvenser. Detta möjliggör analys av DNA-fragment av specifika storlekar och underlättar isoleringen av gener eller specifika DNA-regioner av intresse.

Exonukleaser, som kan katalysera nedbrytningen av nukleinsyror genom att ta bort nukleotider från ändarna av DNA- eller RNA-molekyler. De kan känna igen och skära specifika sekvenser av DNA eller RNA, vilket gör dem oumbärliga verktyg inom molekylärbiologisk forskning och analys. Metalljonberoende DNAzymer, som är konstgjorda DNA-enzymer som uppvisar katalytisk aktivitet i närvaro av specifika metalljoner. Dessa DNA-molekyler kan vika sig till specifika tredimensionella strukturer, vilket gör att de kan binda till metalljoner och utföra katalytiska reaktioner. Genom att designa DNAzymer som kräver specifika metalljoner för sin katalytiska aktivitet är det möjligt att utveckla tester som detekterar närvaron av målgenmanipulation. G-kvadruplexbaserade katalytiska nukleinsyror, vilka är DNA- eller RNA-molekyler som besitter både en G-kvadruplexstruktur och katalytisk aktivitet. Deras unika struktur och katalytiska aktivitet gör dem värdefulla verktyg för känslig, specifik och mångsidig genetisk analys och reglering av genuttryck.

Sammanfattningsvis kan dessa DNA-enzymer känna igen specifika målsekvenser inom det genetiska materialet och katalysera specifika reaktioner. Fördelen med att använda DNA-enzymer för att detektera genmanipulation ligger i deras förmåga att direkt amplifiera och detektera närvaron av modifierade gener utan behov av PCR. Detta eliminerar komplexiteten och tiden som krävs för PCR-amplifiering och förenklar den övergripande detektion-sprocessen. Dessutom kan DNA-enzymer erbjuda hög specificitet och känslighet, vilket möjliggör noggrann identifiering av genmanipulation. Dessutom är DNA-enzymer mer stabila och kostnadseffektiva jämfört med traditionella PCR-baserade metoder. De kräver inte avancerad laboratorieutrustning eller specialiserade tekniker för analys. Det gör dem mer tillgängliga och genomförbara för omfattande användning inom antidopinginsatser.

Avslutningsvis visar användningen av olika DNA-enzymer för att detektera genmanipulation stor potential för att ersätta den komplicerade PCR-detektionsmetoden. Dessa enzymer erbjuder fördelar som enkelhet, noggrannhet, hög specificitet och kostnadseffektivitet. Vidare forskning och utveckling inom detta område kan bidra till förbättring av antidopningsåtgärder inom idrottssamhället.

CRISPR-metoder

Förutom de vanligt använda DNA-enzymerna har även CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-tekniken, välkänd för sin funktion inom geneditering, visat stor potential inom biosensorik- och bioanalysområdena under de senaste åren. På grund av CRISPR/Cas-systemets DNas/RNas-egenskaper kan dess kombination med olika nukleinsyrigenkännings- och amplifikationsreaktioner användas för mångsidig konstruktion av många kraftfulla metoder för högeffektiv detektion av många målanalyter, inklusive genmanipulation. Jämfört med den traditionella DNAas-baserade analysen etablerad för qPCR, LAMP och NGS erbjuder CRISPR-detektionsmetoden förbättrad känslighet, hastighet, specificitet och mångsidighet vid detektion av specifika DNA-sekvenser.

CRISPR är en väl använt teknik inom genredigering och genetisk ingenjörskonst. Det är ett naturligt immunsystem som finns hos bakterier och archaea och kan lokalisera och klippa DNA, vilket möjliggör reparation, ersättning eller borttagning av specifika genserier. De centrala principerna för CRISPR-teknologin inkluderar tre huvudkomponenter: single guide RNA (sgRNA), CRISPR RNA (crRNA) och ett fluorescerande rapportergen.

För det första synteteiseras sgRNA från två komponenter: en guiderNA (tracrRNA) och en specifik sekvens. GuiderRNA-delen binder till proteinet Cas och hjälper Cas-enzymet att noggrant lokalisera mål-DNA:t. Den specifika sekvensen används för att känna igen mål-DNA:t. Den paras med en specifik sekvens på mål-DNA:t, bildar en “signalsekvens” som gör att Cas-enzymet noggrant kan identifiera och binda till mål-DNA:t.

För det andra är crRNA är en RNA-molekyl som syntetiskt designad i förväg för att specifikt paras med en specifik sekvens i mål-DNA:t. Inom CRISPR-genomredigering är crRNA konstgjort utformad för att exakt styra aktiviteten hos Cas-enzymet och möjliggöra att det noggrant spjälker mål-DNA:ts sekvens.

För det tredje används fluorescerande rapportergener vanligtvis som märkningsmetoder inom CRISPR-teknologin. Genom att kombinera en fluorescerande gen med målgenen går det att observera om målgenen har modifierats framgångsrikt. Nyligen utvecklade vår grupp framgångsrikt en ny CRISPR/Cas-baserad metod för att utvärdera genmanipulation. På grund av CRISPR/Cas12a och multiplexad rekombinashybridpolymerasamplifikation (RPA, en nukleinsyravförstärkningsteknik som möjliggör snabb och specifik amplifikation av DNA eller RNA från ett prov med hjälp av rekombinasenzym för att underlätta bildandet av DNA-helixar mellan mål-DNA-sekvenser och primrar) visade denna metod hög specificitet och känslighet för snabb, robust och platsbunden detektion av genmanipulation. Dessutom detekterade den framgångsrikt transgener i en cellmodell och kombinerade en fyrplex mikrofluidisk chip för att samtidigt detektera de tre transgenerna.

CRISPR-Cas9:s enastående överlägsenhet har möjliggjort direkta, enkla, selektiva och känsliga analyser vid användning av metoden. Förutom detta har det även rapporterats att CRISPR-deadCas9 används för detektion av genmanipulation. Man har genomfört framgångsrikt detektionen av exogen human erytropoietingenmanipulation baserad på CRISPR/deadCas9. Under optimala förhållanden uppnår den utvecklade analysen framgångsrik högkänslig detektion av genmanipulation i helblodsprover vid koncentrationer av 12.3 fM (7.41 × 105 kopior) och upp till 10 nM (6.07 × 1011 kopior) inom 1 timme.

Masspektrometribaserade metoder

Förutom ovan nämnda detektionsmetoder baserade på nukleinsyra har också de traditionella metoderna för upptäckt av läkemedelsdopning baserade på masspektrometri framgångsrikt tillämpats på upptäckt av gendopning. Nyligen utvecklades en serie masspektrometribaserade metoder för upptäckt av gendopning och tillämpade framgångsrikt de traditionella analytiska metoderna för dopning för att upptäcka nya dopningsmedel. Till exempel använde de HPLC-HRMS/MS för att identifiera närvaron av den exogena proteinkomponenten Cas9 från bakterien Streptococcus pyogenes i serumprover från idrottare. Genom att övervaka missbruket av CRISPR/Cas-systemet av idrottare kan närvaron av gendopning bedömas. Slutligen kan biosensorer, särskilt olika aptasensorer som traditionellt används för upptäckt av läkemedelsdopning, också användas för upptäckt av gendopning.

Sammanfattningsvis har PCR-fria metoder för upptäckt av gendopning unika fördelar jämfört med traditionella PCR-baserade metoder när det gäller användbarhet, detektionskostnad och utrustningskrav. Enligt författarens åsikt kommer PCR-fria metoder för upptäckt av gendopning förhoppningsvis gradvis ersätta PCR-metoder och bli den huvudsakliga metoden för att upptäcka gendopning.

De framtida utvecklingsriktningarna för PCR-fria metoder för att detektera dopning är följande:

Förbättrad känslighet. Att öka känsligheten hos PCR-fria metoder är avgörande för att upptäcka dopningsämnen även vid lägre koncentrationer. Detta kan uppnås genom avancerade tekniker för provberedning, optimerade plattformar för detektion och innovativa strategier för signalförstärkning

Multiplexningskapacitet. Att utveckla PCR-fria metoder som kan detektera flera dopningsämnen samtidigt kommer att kraftigt förbättra deras effektivitet och praktiska användbarhet. Detta kan uppnås genom att designa specifika prob eller primrar som riktar sig mot olika dopningsmål och använda avancerade tekniker för multiplex-detektion

Bärbara och Point-of-Care-enheter. Utvecklingen av bärbara och point-of-care-enheter för PCR-fri detektion av dopning skulle möjliggöra snabb och on-site-analys. Dessa enheter bör vara enkla att använda, användarvänliga och kunna ge exakta och tillförlitliga resultat på kort tid

Integration med andra analytiska tekniker Att integrera PCR-fria metoder med andra analytiska tekniker, som masspektrometri eller immunanalyser, kan förbättra selektiviteten och noggrannheten i dopningsdetektionen. Denna integration kan ge kompletterande information och förbättra de övergripande detektionsmöjligheterna

Standardisering och validering. För att säkerställa den breda användningen av PCR-fria metoder för dopningdetektion är det nödvändigt att etablera standardprotokoll och valideringsprocedurer. Detta inkluderar att definiera prestandakriterier, optimera provberedningsmetoder och genomföra omfattande valideringsexperiment med referensmaterial och blindprover

Dataanalys och tolkning. Att utveckla avancerade algoritmer för dataanalys och tolkning specifikt utformade för PCR-fri detektion av dopning kommer att vara avgörande. Detta kommer att möjliggöra en exakt och tillförlitlig identifiering av dopningsämnen baserat på de specifika signaler som genereras av detektionsmetoden. Sammantaget kommer den framtida utvecklingen av PCR-fria metoder för att detektera dopning att fokusera på att förbättra känsligheten, möjliggöra multiplexningskapacitet, utveckla bärbara enheter, integrera med andra analytiska tekniker, standardisera protokoll och förbättra algoritmer för dataanalys och tolkning.

Jämförelse mellan olika metoder

Dopningstestmetoder kan grovt indelas i två kategorier: läkemedelsdopning och gendopning. De mest använda metoderna för dopningstestning är GC-MS och LC-MS/MS, som är baserade på masspektrometri. Dessa är kraftfulla analytiska tekniker som möjliggör detektion av spårämnen av förbjudna substanser och lågnivåmetaboliter av förbjudna substanser i biologiska prover. Andra metoder, såsom fluorescens, elektrokemiska och kolorimetriska metoder, har fördelar jämfört med MS-baserade metoder när det gäller enkelhet och kostnad, men resultatens noggrannhet och känslighet är inte lika goda som för MS. För detektering av gendopning finns för närvarande två huvudtyper av tester: PCR och PCR-fria metoder. Båda metoderna har sina egna fördelar och nackdelar. PCR-metoden har bättre känslighet och kan detektera även en enda kopia av mål-DNA. Dessutom har PCR-metoden överlägsen specificitet genom användning av två primrar som binder specifikt till målsekvensen. Å andra sidan har PCR-fria metoder fördelar när det gäller tidsåtgång för detektion, teknologi och krav på instrument. Sammanfattningsvis har alla dessa tester sina egna fördelar och begränsningar, och var och en används baserat på specifika krav och omständigheter. Valet av test beror på de ämnen som testas och den noggrannhet, känslighet och specificitet som krävs för detektion.

Slutsatser och framtidsperspektiv

Under en längre tid har användningen av dopning allvarligt underminerat principerna om rättvisa och rättvisa inom tävlingssport och haft en betydande påverkan på den holistiska utvecklingen av sport. Lyckligtvis har strikta åtgärder vidtagna av reglerande myndigheter mot dopning, tillsammans med kontinuerliga framsteg och mognad av dopningsteknologier, effektivt mildrat det olagliga användandet av förbjudna ämnen bland idrottare. Anmärknings-värda framsteg inom MS-fältet har underlättat identifieringen av små mängder förbjudna ämnen eller deras metaboliter i biologiska prover och därigenom lagt grunden för utvecklingen av kompletterande teknologier såsom fluorescensmetoder, elektrokemiska metoder, kolorimetriska metoder och olika biosensorer. Dessutom genomförs en jämförande analys av fördelar och nackdelar för varje detektionsmetod. Slutligen ges en kort diskussion om de framtida riktningarna för att detektera dessa två former av dopning.

När det gäller den framtida riktningen för dopningstestning hävdar författaren att den främst omfattar följande tre aspekter:

Utveckling av höggenomströmningssensorer för att möjliggöra samtidig identifiering av flera kategorier av dopningsämnen

Integration av nukleinsyraamplifiering, nanomaterialförstärkning och andra innovativa signalamplifieringstekniker för att uppnå högkänslig detektion av dopningsmolekyler i komplexa prover

Konstruktion av integrerade och miniatyriserade sensorer för att tillgodose kraven för on-site-detektion av dopningsämnen

Det är viktigt att notera att utvecklingen av förbjudna ämnen som kan förbättra idrottsprestationen är en pågående strävan för att undvika övervakning. Följaktligen kommer strävan efter dopningstestning att fortsätta, vilket kräver kontinuerliga uppdateringar och innovationer inom metodologin för dopningstestning.

Diagnosticering av gendoping med erytropoietin

Emmanuelle Charpentier och Jennifer Doudna tilldelas 2020 års Nobelpris i kemi för upptäckten av ett av genteknikens mest användbara verktyg: gensaxen. Officiellt kallas den CRISPR/Cas9. Det är enzymet Cas9 som är saxen som klipper av DNA-molekylen. För att saxen ska klippa på rätt ställe i genomet tillverkas en bit RNA, en enkelsträngad molekyl som passar ihop med en sekvens på DNA-molekylen som ska klippas, och det är den sekvensen som guidar Cas9 till målet.

Man framställde nu en ensträngad molekyl, complemental single guide RNA (sgRNA), som band till ett segment med fyra exon-exon-stycke i det humana erytropoieteinets DNA och kunde sedan använda CPISPR/Cas9-metoden för att mäta mängden exogent erytropoietin i blodet.

Metoden är naturligtvis inte enkel, men den kommer att kunna automatiseras så att den blir både billig och snabb. Mycket arbete återstår för att kunna använda den i rutinen vid dopingkontrollanalyser, men det är ändå intressant att metoden så snabbt har fått en praktisk applikation också inom antidopingen.

En ny metod för påvisande av gendoping (erytropoietin)

Gendopning har klassificerats som en förbjuden metod av World Anti-Doping Agency (WADA) och International Olympic Committee (IOC) i över två decennier. Genetiska terapeutiska in vivo-metoder är baserade på överföring av nukleinsyror eller nukleinsyraanaloger till människokroppen, till exempel via intravenösa eller direkta vävnadsinjektioner (exempelvis intramuskulära). Överföringen av transgena DNA-sekvenser kan uppnås med olika strategier, inklusive användning av rekombinanta virala vektorsystem (som adenovirala eller adeno-associerade virala (AAV) system) eller icke-virala vektorer (som bakteriella plasmider eller minicirkulära DNA) som antingen kan överföras “nakna” (ofta assisterade av fysisk kraft) eller komplexerade med till exempel kationiska lipider eller polymerer. När produktion, överföring och expressionsmetoder förfinas och förbättras, kan en ökad överföring av genetiska terapimetoder till klinisk standardvård och deras kommersiali-sering på läkemedelsmarknaden förutses, vilket gör gendopningstillbud alltmer sannolika.

År 2021 godkände WADA det första protokollet för genetisk dopningstestning för detektion av exon–exon-anslutningar av intronlösa komplementärt DNA (cDNA)-sekvenser från den mänskliga erytropoietingenen (EPO) i helblod genom användning av kvantitativ realtids-PCR (qPCR). Andra metodologiska tillvägagångssätt via (nested) end-point polymeraskedje-reaktion (PCR), digital PCR (dPCR), clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated with protein-9 (CRISPR-Cas9)-systemet och Next-Generation Sequencing (NGS) har utvecklats och testats under forskningsförhållanden med samma allmänna detektionsstrategi genom att rikta in sig på exon–exon-anslutningar av humana cDNA-sekvenser från EPO eller andra genetisk doping-relevanta gener (till exempel GH1, VEGF-A, FST och IGF-1). Gemensamt för de flesta av dessa tillvägagångssätt är dock antingen deras begränsade detektionspotential när det gäller antalet målbara exon–exon-anslutningar per reaktion (till exempl i fallet med qPCR och dPCR) eller deras kostsamma och tekniskt krävande tillämpning. Därför är mer omfattande och högpresterande testalternativ önskvärda.

Nu har utvecklats en ny högplexigengenpanel i samarbete med Agena Bioscience (San Diego, CA, USA) som möjliggör en multi-mål-detektionsmetod med användning av matrix-assisterad tidvågs laser-desorption/ionisation (MALDI-TOF) masspektrometri (MS) [24]. Den nya metoden är baserad på en 20-plex PCR-amplifieringssteg och en efterföljande single-base extension (SBE)-procedur med en slutlig detektionsfas med användning av MALDI-TOF MS.

Två produkter tillgängliga via internetbaserade leverantörer och marknadsförda som innehållande material med erytropoietin-gen och IGF1-gen analyserades för närvaro av potentiella gendopningsmedel med hjälp av en nyutvecklad analytisk metod. Denna metod möjliggjorde detektering av transgent DNA motsvarande sju potentiella proteiner (EPO, FST, GH1, MSTN (Propeptid), IGF1, VEGFA och VEGFD) genom en 20-plex polymeraskedjereaktion (PCR) följt av enkel basförlängning (SBE)-reaktion och efterföljande analys av SBE-produkter via matrix-assisterad tidvågs laser-desorption/ionisation masspektrometri (MALDI-TOF MS).

I den aktuella undersökningen analyserades två produkter från internetbaserade leverantörer för närvaron av potentiella gendopningsmedel med hjälp av en nyutvecklad multipel panel för gendopingtester. Två olika produkter (här benämnda EPO-P och IGF1-P), presenterade som formuleringar innehållande nukleinsyror lämpliga för förbättring av idrottsprestationer, beställdes via en webbsida. EPO-P beskrevs som en plasmid som kodar för EPO-gen, medan IGF1-P skulle innehålla en plasmid med IGF1-genen. EPO-P beskrevs dessutom som en syntetisk gen som, vid transkription, producerar funktionell erytropoietin och ger lokala och systemiska effekter. CpG-motiven inom plasmiden skulle också positivt stimulera kroppens immunsystem. Produkterna påstods vara “säkra” utan mutagena effekter på det mänskliga genomet. Båda produkterna skulle injiceras intramuskulärt vid en koncentration av 0,04–2,85 mikrog/kg för IGF1-P eller 1 mikrog/kg för EPO-P var femte dag.

Extrakt från båda produkterna visade sig innehålla transgent EPO-DNA, medan transgent DNA för IGF-1 inte detekterades. Resultaten bekräftades med SYBR Green qPCR med primer sets riktade mot EPO och IGF1 cDNA samt CMV-promotorsekvensen. I denna fallstudie rapporteras för första gången detektion av autentiska (om än lågkoncentrerade) transgener, potentiellt avsedda för gendopningspraxis, i kommersiellt lättillgängliga produkter.

Ett robust test för att upptäcka gendopning för anabol förbättring

Framgång inom genterapi vid behandling av sjukdomar hos människor gör denna teknik attraktiv för att förbättra också idrottsprestationen, vilket skapar ett behov av gendopnings-detektering. 2021 godkände World Anti-Doping Agency (WADA) det första gendopnings-testet. Här beskriver vi en ny metod för att upptäcka dopning med ytterligare fyra gener:

follistatin

tillväxthormon 1

tillväxthormonfrisättande hormon

IGF 1,

Metoden använder fyra hydrolysprobbaserade polymeraskedjereaktionsanalyser (PCR) som riktar sig mot transgenerna baserat på den kodande sekvensen för de fyra endogena generna. Analyserna är specifika, reproducerbara och kan detektera fem kopior av transgenen i närvaro av mycket liknande endogen gen i 25 000 gångers överskott. För att underbygga tillförlitlig och jämförbar rutinmetodprestanda av dopningstestlaboratorier designades och genererades ett syntetiskt referensmaterial för metoden enligt ISO Guide 25.

För att underbygga tillförlitlig och jämförbar rutinmetodprestanda av dopningstestlaboratorier designades och genererades ett syntetiskt referensmaterial för metoden enligt ISO Guide 35. Den kompletta metoden validerades i blodprover med plasma som extraktionsmatris och QIAamp DNA blod midi DNA extraktion utrustning. Alla blodprover från olika donatorer (n=8) som simulerades vara negativa eller positiva (1500 transgenkopior spetsade per milliliter blod) för transgenerna rapporterades korrekt. Den nya metoden som riktar sig mot ytterligare fyra gener kommer att utöka kapaciteten hos laboratorier som är involverade i dopingkontroll för att skydda idrottares hälsa, rättvisa och jämlikhet.

HiGDA lyckades detektera 2,5 kopior av exogen hEPO-en på 90 min

Gendopning och är förbjudet av WADA. För närvarande har de klustrade regelbundet mellanrum korta palindromiska upprepningar-associerade protein (Cas)-relaterade analyserna använts för att detektera genetiska brister eller mutationer. Bland Cas-proteinerna fungerar deadCas9 (dCas9), en nukleasbristmutant av Cas9, som ett DNA-bindande protein med ett målspecifikt enkelguide-RNA.

På basis av dessa principer utvecklades en dCas9-baserad high-throughput gendopningsanalys (HiGDA) för exogen gendetektion. Analysen omfattar två distinkta dCas9s, en magnetisk pärla immobiliserad capture dCas9 för exogen genisolering och en biotinylerad dCas9 med streptavidin-polyHRP som möjliggör snabb signalförstärkning.

Med denna metod lyckades man detektera målgenen i en koncentration så låg som 12,3 fM (7,41 × 10)5 kopior) och upp till 10 nM (6,07 × 1011 kopior) i ett helblodsprov inom 1 timme med HiGDA.

När man ​​antog ett exogent genöverföringsscenario upptäckte man den exogena humana erytropoietingenen i koncentrationer så låga som 2,5 kopior inom 90 minuter i 5 mikroL av blodprovet. Således är HiGDA en snabb, känslig och praktisk detekteringsmetod för gedoping.

Ny metod för att avslöja gendoping med PCR

Framgång inom genterapi vid behandling av sjukdomar hos människor gör denna teknik attraktiv för att förbättra idrottsprestationer, vilket skapar ett behov av att kunna upptäck sådan gendopning. 2021 godkände WADA det första gendopningstestet.

Här beskriver vi en ny metod för att upptäcka dopning med ytterligare fyra gener, follistatin, tillväxthormon 1, tillväxthormonfrisättande hormon och insulinliknande tillväxtfaktor 1, som kan förbättra prestationsförmågan genom att öka muskelstorlek och styrka.

Metoden använder fyra hydrolysprobbaserade polymeraskedjereaktionsanalyser (PCR) som riktar sig mot transgenerna baserat på den kodande sekvensen för de fyra endogena generna. Analyserna är specifika, reproducerbara och kan detektera fem kopior av transgenen i närvaro av mycket liknande endogen gen i 25 000 gångers överskott. För att underbygga tillförlitlig och jämförbar rutinmetodprestanda av dopningstestlaboratorier designades och genererades ett syntetiskt referensmaterial för metoden enligt ISO Guide 35. Den kompletta metoden validerades i blodprover med plasma som extraktionsmatris och QIAamp DNA blod med DNA extraktion utrustning. Alla blodprover från olika donatorer (n=8) som simulerades vara negativa eller positiva (1500 transgenkopior spetsade per milliliter blod) för transgenerna rapporterades korrekt. Den nya metoden som riktar sig mot ytterligare fyra gener kommer att utöka kapaciteten hos laboratorier som är involverade i dopingkontroll för att skydda idrottares hälsa, rättvisa och jämlikhet.

Förbättrade metod för att avslöja gendoping genom sgRNA-identifiering

Oro för genmanipulering har stadigt ökat på grund av framsteg inom genetisk ingenjörskonst, särskilt med framväxten av verktyg baserade på clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated (CRISPR/Cas). Dessa verktyg erbjuder inte bara oöverträffade möjligheter för olaglig prestationsförbättring av idrottare utan erbjuder också nya vägar för upptäckt av genmanipulering genom biosensorer för nukleinsyror. Därför följde vi upp på en tidigare studie genom att optimera en analytisk metod baserad på reverse transcriptase-recombinase polymerase amplification (RT-RPA) och efterföljande kvalitativ detektion av nukleinsyror med hjälp av specific high sensitive enzymatic reporter unLOCKing (SHERLOCK) för direkt detektion av sgRNA associerad med Streptococcus pyogenes i serum. Detektionsenheten, testparametrar och provhantering justerades för att övervinna tidigare identifierade testbegränsningar. Den genomförda metodkaraktäriseringen bekräftade metodens specificitet och ökade detektionskänsligheten från 100 pM till 1 fM sgRNA i 100 μL serum. Dessutom genomfördes omtestning av in vivo-musadministrationprover som samlats in i en tidigare konceptstudie, med framgångsrik identifiering av sgRNA i alla förväntade prov efter administration inom den 24-timmars samlingsperioden. Dessa resultat stöder tillämpningen av den förbättrade analytiska metoden för upptäckt av olagliga dopningsförsök via ribonukleoproteinbaserad CRISPR/Cas-applikation genom sgRNA-identifiering och erbjuder en ny potentiell dopningskontrollstrategi för CRISPR-relaterad genmanipulering.

Upptäckt av bloddoping med genteknik

Det gjordes genotypningsanalys av mänskliga biallela polymorfismer (enkelnukleotid-polymorfismer) för detektering av homolog blodtransfusion vid dopning inom idrotten. DNA extraherades från torkade blodfläckar och kvantifierades med hjälp av realtids snabb PCR. Metoden visade sig möjliggöra detektion av transfusioner upp till en donatorandel på 1 procent, med en betydande förbättring av känsligheten jämfört med både den referens-baserade cytoflorimetrimetoden och en tidigare föreslagen strategi baserad på DNA STR-baserad metod.

En modell för gendopning med erytropoietingenen med relevant testmetod

Med den snabba utvecklingen av genterapiteknologi under de senaste åren har dess missbruk som en metod för dopning inom idrott blivit en oro. Det finns dock fortfarande utrymme för förbättringar av testmetoderna för gendopning, och en robust djurmodell behöver utvecklas. Syftet med denna studie var därför att etablera en modell för gendopning med hjälp av rekombinant adeno-associerat virus vektor-9, inklusive den mänskliga erytropoietingenen (rAAV9-hEPO), samt att etablera en relevant testmetod. Först försökte man etablera modellen med rAAV9-hEPO på möss. Resultaten visade en signifikant ökning av erytrocytvolymen åtföljd av en ökning av mjältvikten, vilket bekräftade modellens giltighet. Därefter försökte man upptäcka bevis på gendopning genom att rikta in oss på DNA och RNA. Direkta bevis på gendopning upptäcktes med hjälp av en TaqMan-qPCR-analys med vissa primers/prober. Dessutom identifierades vissa indirekta bevis i RNA genom en kombination av en TB Green qPCR-analys och RNA-sekvensering. Sammantaget kan dessa resultat utgöra grunden för ett effektivt test för gendopning hos mänskliga idrottare i framtiden.

Mikrochipteknik för detektering av gendoping

Med betydande framsteg i förståelsen av genfunktioner och terapi har det potentiella missbruket av genteknologier, särskilt inom idrott genom gendoping (GD), blivit en viktig fråga. Detta väcker oro över behovet av testning på plats för olika GD-kandidater för att motverka otillåtna metoder inom sport. Dock saknar nuvarande GD-detektionstekniker, såsom PCR, den bärbarhet som krävs för på-plats och multiplicerad detektion.

I en studie introduceras ett integrerat mikrofluidikbaserat chip för multiplicerande gendopingdetektion, benämnt MGD-Chip. Genom en strategisk design av hydrofila och hydrofoba kanaler möjliggör MGD-Chip att RPA- och CRISPR-Cas12a-assayen kan utföras sekventiellt på enheten, vilket säkerställer minimal störning och korskontaminering. Sex potentiella GD-kandidater valdes ut och testades framgångsrikt samtidigt på plattformen inom 1 timme. Plattformen visade exceptionell specificitet och uppnådde en detektions-känslighet på 0,1 nM för icke-amplifierade målplasmider och 1 aM för amplifierade. Validering med hjälp av musmodeller, där IGFI- och EPO-transgener injicerats, bekräftade plattformens effektivitet för att upptäcka gendoping i riktiga prover. Denna teknologi, som kan detektera flera mål med hjälp av bärbara element, visar potential för realtidsdetektion av GD vid sportevenemang och erbjuder en snabb, mycket känslig och användarvänlig lösning för att upprätthålla idrottstävlingars integritet.

3D-genomteknologi ger nya möjligheter och nya svårigheter

Med utvecklingen av genredigeringsteknik kommer många genetiska sjukdomar att kunna behandlas effektivt, men samma teknik har också möjliggjort dopning i form av gendopning, vilket utgör ett hot mot idrotten. WADA har uttryckligen angett gendopning som en förbjuden metod (M3) i Förbudslistan och har godkänt qPCR-detektion för detta ändamål.

Dock kan gendopning lätt undvika upptäckt. Om reglerande element uppströms om målgenerna beaktas, blir uppgiften ännu mer utmanande. Tekniker som drivs av Hi-C-experiment och 3D-genomteknologi, med perspektiv som topologiskt associerande domäner (TAD) och kromatinloopar, ger en mer omfattande och djupgående förståelse av genreglering och genuttryck. Detta möjliggör bättre förebyggande av potentiell användning av gendopning på 3D-genomnivå.

I föreliggande arbete utforskas gendopning ur ett nytt perspektiv genom att analysera senaste studier om gendopning och undersöka relaterade gener inom ramen för 3D-genomet.

Aktuellt 2025 om möjligheter att upptäcka gen- och celldoping

Mot bakgrund av de betydande och snabbt framväxande framstegen inom modifiering, manipulering och påverkan av genuttryckshastigheter har utvecklingen av detektions-strategier för potentiella former av gendoping nödvändigtvis och oundvikligen blivit ett priori-terat ämne inom antidopingforskning. Med allmänna principer för till exempel transgen-detektion redan på plats i antidopinglaboratorier, krävs alternativa och/eller heltäckande kompletterande metoder – både med tanke på den växande listan av potentiella mål-gener (som antas positivt påverka idrottsprestationer) och det ökande antalet kodonoptimerade varianter som kan minska eller till och med upphäva detektionsförmågan hos enskilda testmetoder. Samtidigt gäller restriktioner och begränsningar för icke-biaserade genomiska profilanalyser, särskilt i syfte att användas för dopningstester inom idrotten.

Det har etableradts en musmodell för att utvärdera detektionsstrategier vid administrering av transgener via en rekombinant adenoassocierad virusvektor (rAAV), med det humana erytropoietingenen (rAAV9-hEPO) som exempel. Efter injektion av rAAV9-hEPO-vektorn samlades blodprover (50 μL) in upp till 30 dagar och analyserades med Taqman qPCR, riktad mot två EPO-exon–exon-övergångar samt ett cytomegaloviruspromotorelement (CMVp). Detta visade att transgenen kunde spåras i upp till 30 dagar, med en analys-sensitivitet som krävde 34–104 kopior av det virala genomet per mikroL. Dessutom rapporterades kraftigt uppreglerade genuttrycksprofiler för asparaginsyntetas, serinhydroxy-metyltransferas och metylenetetrahydrofolatdehydrogenas, och möjligheten att inkludera dessa i framtida ABP-övervakningsprogram diskuterades.

Behovet av robusta testmetoder underströks av en studie, som rapporterade om identif-ieringen av produkter (marknadsförda för prestationshöjning och köpta från internetbaserade leverantörer) som innehöll transgent EPO-DNA. En testmetod som möjliggjorde samtidig detektion av sju transgenmål (erytropoietin, follistatin, GH1, myostatinpropeptid, IGF1 samt vaskulär endotelial tillväxtfaktor A och D) utvecklades. Denna metod använde multiplexad PCR-baserad amplifiering av minst två exon–exon-övergångsregioner för varje transgen. Ampliconerna användes för enkelbasförlängningsreaktioner, och detektion av enkelbasför-längda primrar via MALDI-MS bekräftade förekomsten av en transgen, såsom i det aktuella fallet för EPO.

Genom att utnyttja specificiteten hos Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) och CRISPR-associerade (Cas) proteinbaserade reaktioner har presenterats en snabb och multiplexad testanordning för att detektera sex transgener (vaskulär endotelial tillväxtfaktor A, HIF1, EPO, GH1, IGF1 och alfa-aktinin-3) i helblod. I ett åttakanaligt mikrofluidikchip tilldelades sex kanaler var sin transgen (plus två negativa kontroller), där rekombinaspolymerasamplifiering (RPA) och CRISPR-RNA (crRNA)-designer, specifikt riktade mot transgenens exon–exon-övergångar, fick verka i följd. I kombination med Cas12a och en karboxyfluorescein-märkt rapportersond erhölls testresultat inom 40 minuter vid en koncentration på 10⁻¹⁸ mol/L.

Som proof-of-concept fick möss en injektion av 0,4–10 mikroL av ett rAAV9-hIGF1-konstrukt (total virustiter = 5,26 × 10¹² vg/mL) eller ett naket hEPO-plasmid (25–100 mikrog), och blodprover (100 mikroL) samlades in under 20 respektive 2 dagar. Analyserna möjliggjorde en tydlig åtskillnad mellan negativa kontroller och blodprover efter administrering, även om skillnaden i signalstyrka för hEPO-experimentet diskuterades som mindre framträdande jämfört med rAAV-baserade interventioner.

Förutom möjligheten att använda CRISPR/Cas-systemet för att detektera transgener visades det också kunna användas för analys av CRISPR/Cas-baserade genredigeringsförsök. Genom att tillämpa liknande principer som ovan riktades denna metod mot den konserve-rade regionen av CRISPR:s single guide RNA (sgRNA) associerad med Streptococcus pyogenes. Denna region amplifierades först med omvänt transkriptas (RT)-RPA och exponerades därefter för CRISPR/Cas13a med ett specifikt crRNA i närvaro av en fluorescensmärkt rapportersond känslig för RNAse-aktivitet. Även här användes en musmodell för att bedöma metodens användbarhet. Intravenös och intramuskulär injektion av 600 pmol sgRNA kunde detekteras i alla blodprover som samlades in under 24 timmar, och metodens detektionsgräns uppskattades till 1 fM vid användning av 100 mikroL serum.

Upptäckt av gendopning ur ett 3D-perspektiv

Med utvecklingen av genredigeringsteknik har många genetiska sjukdomar kunnat behandlas effektivt, men samma teknik har också gjort det möjligt för dopning att utgöra ett hot mot idrotten i form av gendopning. WADA har uttryckligen listat gendopning som en förbjuden metod (M3) i sin Förteckning över förbjudna metoder och godkänt qPCR för detektion.

Gendopning kan dock lätt undgå upptäckt, och om man även beaktar de reglerande elementen uppströms om målgenerna blir uppgiften ännu mer utmanande. Den Hi-C-experimentbaserade 3D-genomteknologin ger, genom perspektiv som topologiskt associerande domäner (TAD) och kromatinloopar, en mer heltäckande och djupgående förståelse av genreglering och genuttryck, vilket i sin tur kan bidra till att bättre förebygga potentiellt utnyttjande av gendopning på 3D-genomnivå.

I detta arbete kommer det att undersöksa gendopning ur ett annat perspektiv genom att analysera nyare studier om gendopning och utforska relaterade gener i ett 3D-genomsammanhang.

qPCR-analyser kan fånga signaler från transgener

Genetiska/genomiska manipulationstekniker (gentillförsel/-leverans, genredigering och så vidare) har blivit allt mer utvecklade, och den illegala användningen som gendoping inom idrotten har väckt uppmärksamhet. WADA förbjuder strikt gendoping och har utfärdat riktlinjer för detektion med kvantitativ realtids-PCR (qPCR).

Den tekniska utformningen av qPCR gör det dock svårt att upptäcka nya dopingsmål, och kodonförändringar i målgenerna kan också påverka detektionsförmågan. Här förbereder vi standardmaterial för genomiska och transgena versioner av den mänskliga EPO-genen (hEPO), och designar qPCR-primers för att undersöka konsekvenserna av kodon-förändringar vid detektion av gendoping.

Vi bekräftar att noggrant utformade qPCR-analyser faktiskt kan fånga signaler från trans-gener, men att kodonförändringar i transgenen kraftigt kan försämra detektionseffektiviteten. Vi har också efterliknat ett verkligt scenario för gendoping genom att blanda genomiska och transgena versioner av hEPO, och qPCR kunde detektera vildtyptransgenen men inte transgener med kodonförändringar.

Som metodverifiering för denna utmaning använder man även Sanger-sekvensering, och visar att sekvensering enkelt kan upptäcka gendoping även vid kodonändrade transgener. Vår studie bekräftar att kodonförändringar utgör en utmaning för qPCR-baserad detektion av gendoping, och efterlyser mer opartiska detektionsverktyg baserade på högkapacitets-sekvensering i framtiden.

Gendopingdetektion baserad på DBS

Doping har fortsatt att utvecklas i takt med medicinska framsteg, och metoderna har blivit alltmer sofistikerade. Särskilt har genterapitekniken utvecklats snabbt. Denna teknik har lett till betydande genombrott i behandlingen av sjukdomar såsom muskeldystrofi, spinal muskelatrofi och hemofili. Men i takt med att tekniken utvecklas ökar också oron för gendoping inom idrotten. Därför valde WADA att uttryckligen inkludera gendoping i sin Förbudslista och att utöka sina övervakningsinsatser. Vår forskargrupp har undersökt metoder för att upptäcka denna form av doping i över sju år.

Ett av de mest oroande exemplen på gendoping är introduktionen av erytropoietingenen (EPO). EPO i form av rekombinant protein har länge missbrukats av idrottare i olika sporter för att förbättra uthålligheten. Samtidigt har det inom genterapiforskning nyligen rapporterats att rekombinanta adeno-associerade virus (AAV)-vektorer är mycket säkra, och många kliniska prövningar har genomförts. Denna bakgrund tyder på en hög risk att AAV-vektorer i kombination med EPO kan missbrukas för dopingsändamål. Detta understryker i sin tur hur brådskande det är att utveckla en metod för att testa hEPO-gendoping med hjälp av denna vektor.

Vid OS i Paris 2024 införde International Testing Agency (ITA) provtagning med torkad bloddroppe (DBS) för dopingstester och genomförde enligt uppgift analyser för gendoping. Eftersom de specifika metoderna inte har offentliggjorts är det dock möjligt att de fortfarande befinner sig i utvecklingsstadiet. Jämfört med traditionell blodprovtagning är DBS en minimalt invasiv teknik som kräver endast en liten mängd blod. Dessutom möjliggör DBS stabil förvaring i rumstemperatur utan behov av fryslagring, vilket avsevärt minskar logistik-kostnaderna. Av dessa skäl framstår DBS som ett rimligt verktyg för framtida tester av gendoping.

I takt med att detekteringsteknikerna utvecklas kvarstår minimering av kontamineringsrisken som en avgörande utmaning. Oavsett hur sofistikerade testmetoderna är kan felhantering av prover introducera kontaminanter och därmed riskera att idrottare felaktigt anklagas för doping. Ett sätt att minska denna risk är att automatisera provförbehandling och DNA-extraktion med hjälp av den humanoida laboratorieroboten (LabDroid) ”Maholo.” Vår forskargrupp har använt Maholo för DNA- eller RNA-extraktion och för att skapa bibliotek för nästa generations sekvensering (NGS). Denna robot är utformad för att hantera nukleinsyra-prover och kan utföra experiment automatiserat utan mänsklig inblandning, vilket kan bidra avsevärt till att förhindra kontaminering och oredlighet i laboratoriet. Dessutom kan roboten anpassas efter forskarnas behov, vilket gör den användbar inte bara för nukleinsyror utan även för andra tillämpningar. I praktiken har roboten automatiskt kunnat skapa inducerade pluripotenta stamceller (iPS-celler) och iPSC-härledda retinala pigmentepitelceller (iPSC-RPE). Vidare har vår forskargrupp framgångsrikt använt roboten inom veterinärmedicinsk forskning för att skapa DNA-bibliotek för NGS. Dessa faktorer tyder på att Maholo skulle vara särskilt fördelaktig vid tester för gendoping. Dessutom har vår forskargrupp utvecklat teknik för omfattande DNA-analys via bioinformatisk analys, vilken också potentiellt skulle kunna tillämpas vid tester för gendoping.” Mot denna bakgrund genomfördes denna studie för att utveckla en testmetod för gendoping med användning av torkad bloddroppe (DBS), NGS och LabDroid ”Maholo”.

Som ett första steg injicerades rekombinant adeno-associerat virus som innehöll den humana erytropoietingenen (hEPO) i möss för att etablera en gendopingmodell. Därefter skapades DBS med hjälp av helblod. Maholo användes för att extrahera DNA från DBS och för att skapa DNA-bibliotek för NGS. NGS i kombination med bioinformatisk analys identifierade tydligt DNA-fragment som gav otvetydiga bevis på gendoping i musmodellen, vilka saknades hos kontrollmusen.

Såvitt vi känner till är detta det första försöket att använda en biologisk modell av hEPO-gendoping i kombination med Maholo, NGS och DBS. Denna metod bör underlätta den fortsatta utvecklingen av testmetoder för gendoping.

Samtidig detektion av sju transgener för analys av gendoping hos människa

Sedan 2003 har ”gendoping” inkluderats på listan för att motverka det potentiella missbruket av metoder som härrör från det då framväxande området genterapi. Gendoping beskriver användningen av nukleinsyror eller deras analoger samt genterapeutiska tekniker, såsom genredigering, i syfte att förändra en idrottares naturliga genetiska uppsättning för presta-tionshöjning. Även om förekomsten av gendoping under många år betraktades som ett relativt osannolikt dopningsscenario, har den allt snabbare utvecklingen av genterapier som nu avancerar till kliniska studier och praktisk användning, tillsammans med framväxten av produkter relevanta för gendoping på den öppna marknaden, väckt oro kring den faktiska användningen av otillåtna nukleinsyrabaserade metoder och läkemedel inom tävlingsidrott.

Införandet av gendoping som en förbjuden metod i Förbudslistan har initierat mångfacet-terade insatser för dess detektion. Eftersom gendopningsstrategier kan använda ett brett spektrum av metoder och former av nukleinsyror (exmpelvis leverans av transgener via virala eller icke-virala vektorer, tystande oligonukleotidläkemedel, genredigeringssystem såsom CRISPR/Cas), liksom ett stort antal potentiella målsekvenser, är det sannolikt att komplet-terande metoder kommer att behövas för att möjliggöra tillförlitlig detektion. Nuvarande angreppssätt sträcker sig från enkelplex realtidskvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR) till helgenomsekvensering (WGS).

qPCR-tester är mångsidiga, snabba och mycket känsliga, men kan begränsas av antalet analyser som kan kombineras i en och samma reaktion. Nästa generations sekvensering (NGS) kan ge omfattande information om förändringar i idrottarens genom och transkriptom och möjliggör dessutom obiaserade analyser. Samtidigt är NGS-analyser relativt tidskrä-vande, tekniskt och bioinformatiskt resurskrävande samt fortsatt kostsamma. Därtill kvarstår etiska betänkligheter kopplade till breda sekvenseringstekniker på människa, vilket potentiellt försvårar tillämpningen av teknologin för dopningskontroll inom idrotten. Hittills har endast ett gendopningstestprotokoll rapporterats som WADA-ackrediterat: en enkelplex qPCR-metod för detektion av humant transgent erytropoietin (EPO).

Masspektrometri (MS) är en allmänt använd analytisk teknik i dopningskontrollaboratorier. Vätskekromatografi–tandem-masspektrometri (LC–MS/MS), kvadrupol–time-of-flight-tandem-masspektrometri (Q-TOF MS/MS) och matrixassisterad laserdesorption/jonisation-time-of-flight-masspektrometri (MALDI-TOF MS) har framgångsrikt testats för sin användbar-het vid detektion av kemiskt modifierade oligonukleotider (hos människa och häst), men har hittills uppvisat lägre känslighet jämfört med PCR-baserade metoder. Följaktligen har koppling av PCR-amplifiering och MS, i syfte att öka detektionskänsligheten samtidigt som man utnyttjar den höga multiplexkapaciteten hos spektrometriska metoder, undersökts.

I den här presenterade ansatsen utvecklades en panelprototyp för detektion av sju potenti-ella humana gendopningstransgener i en och samma reaktion. Dessa transgener anses relevanta för att förbättra muskelstyrka och uthållighet genom ökad syresättning av muskulaturen (erytropoietin (EPO), vaskulära endoteliala tillväxtfaktorer A och D (VEGFA, VEGFD)) eller ökad muskelmassa (follistatin (FST), tillväxthormon (GH1), insulinliknande tillväxtfaktor I (IGF1), myostatin (propeptid, MSTN)). Vissa av dessa har redan gått in i kliniska prövningar inom genterapi.

Detektionsförfarandet utnyttjar en metod för detektion av enkelnukleotidpolymorfier (SNP) med MALDI-TOF MS, ursprungligen utvecklad för genotypning av prover (kallad iPLEX®), och kombinerar denna med den nuvarande strategin för gendopningsdetektion via amplifi-ering av exon–exon-kopplingar (eftersom intronlösa exon–exon-kopplingar i komplementärt DNA (cDNA) kan indikera förekomst av en exogen transgen). I den kombinerade metoden följs en 20-plex PCR-reaktion av en enkelbasförlängning (single base extension, SBE) av korta oligonukleotidprimrar (s.k. extensionsprimrar, EP) med hjälp av dideoxynukleotid-trifosfater (ddNTP) direkt över exon–exon-kopplingsställena.

För att öka känsligheten ingår ytterligare ett PCR-steg (före SBE-reaktionen) i metoden. De enkelbasförlängda primrarna (SBE-produkter) kan därefter joniseras med MALDI och detekteras med TOF-MS, där de (huvudsakligen enkel-laddade) jonerna identifieras utifrån sitt karakteristiska mass-till-laddningsförhållande (m/z). I den föreliggande studien utvärderades panelprototypen avseende prestanda och lämplighet som en ny multiplex detektionsmetod för gendoping hos människa.

Undersökningen omfattar 20 analyser för detektion av exon-exon-kopplingar hos sju humana transgener (EPO, FST, GH1, IGF1, MSTN [propeptid], VEGFA, VEGFD), vilka har identifierats som relevanta mål för rutinmässiga dopningskontroller, i en och samma reaktion. Parallellt utformades och testades även ett lämpligt referensmaterial (RM) för att utvärdera dess användbarhet.

En uppskattad LOD95 (detektionsgräns med 95 % sannolikhet) på 1 500 kopior per milliliter (cp/mL), motsvarande 30 kopior (cp) per reaktion för panelen, samt 500 cp/mL eller 10 cp per reaktion för referensmaterialet, fastställdes i humana helblodsprover som spetsats med plasmider.

De undersökta genernas och referensmaterialets specificitet och tillämpbarhet fastställdes ytterligare genom analys av hästplasmprover från ett djur som erhållit humant transgent EPO levererat via rekombinant adenoassocierat virus (rAAV), samt 111 inhemska humana dopningskontrollprover.

Detektion av gendoping baserat på mRNA inkapslade i lipidnanopartiklar

Mediciner baserade på budbärar-RNA (mRNA), särskilt sådana som är inkapslade i lipidnanopartiklar (LNP), uppvisar stor potential för tillämpningar såsom vacciner och genterapier. Samtidigt understryker farhågor kring deras potentiella missbruk i sammanhang som idrottsdopning behovet av robusta detektionsplattformar. Här presenterar vi direct-SATORI, en fullt automatiserad och amplifieringsfri plattform som kan detektera mRNA-LNP direkt från blod på enkelmolekylnivå.

Genom att integrera CRISPR-Cas13a, magnetkulbaserad RNA-anrikning och mikrokammar-teknologi uppnår plattformen hög känslighet, med detektionsgränser på 0,4 fM för omodifi-erat mRNA och 3,5 fM för N1-metylpseudouridin (m1Ψ)-modifierat mRNA som kodar för erytropoietin (EPO), ett vanligt mål för konventionella gendopningsstrategier som syftar till att förbättra syretransporten.

Plattformen genomför detektionen inom cirka 10 minuter och uppvisar artsövergripande kompatibilitet, inklusive häst- och humanplasma. In vivo-validering hos häst visade maximal detektion 1 timme efter administrering, med signalutsläckning inom 48 timmar.

Dessa resultat belyser potentialen hos direct-SATORI som ett snabbt, känsligt och praktiskt verktyg för övervakning av mRNA-baserade dopningsmedel och erbjuder en lovande lösning för framtida antidopningsövervakning och regulatorisk tillsyn.

Kodonförändringar utmanar PCR-baserad upptäckt av gendopning

Genetiska och genomiska manipulationstekniker (gentransfer/-leverans, genredigering med mera) har blivit allt mer mogna, och den illegala användningen av dessa som gendopning inom idrotten har väckt ökad uppmärksamhet. WADA förbjuder strikt gendopning och har utfärdat riktlinjer för detektion med kvantitativ realtids-PCR (qPCR). De tekniska egenskaperna hos qPCR gör dock att det är svårt att upptäcka nya dopningsmål, och kodonförändringar (en kodon är en kodon sekvens av tre nukleotider (baser) i DNA eller RNA som anger vilken aminosyra som ska byggas in i ett protein, eller om proteinsyntesen ska starta eller stoppa). i målsekvenser kan dessutom påverka detektionseffektiviteten.

I denna studie har framställts standardmaterial för både genomiska och transgena versioner av den mänskliga EPO-genen (hEPO) och designat qPCR-primers för att undersöka konse-kvenserna av kodonförändringar för upptäckt av gendopning. Det bekräftas att noggrant utformade qPCR-analyser faktiskt kan fånga transgensignaler, men att kodonförändringar i transgenen allvarligt kan försämra detektionseffektiviteten. Man har även efterliknat ett verkligt scenario för gendopning genom att blanda genomiska och transgena versioner av hEPO, där qPCR kunde upptäcka vildtyp, men inte kodonförändrade transgener.

Som metodvalidering för denna utmaning använde vi också Sanger-sekvensering och kunde bekräfta att sekvensering enkelt kan identifiera gendopning även när transgener har kodonförändringar. Vår studie visar att kodonförändringar utgör en betydande utmaning för qPCR-baserad upptäckt av gendopning och understryker behovet av opartiska detektionsverktyg baserade på högkapacitetssekvensering i framtiden.

Osmotiskt justerbara droppar möjliggör amplifikationsfri gendopingdetektion

Gendopning är en växande utmaning inom idrotten och kräver mycket känsliga och specifika detektionsverktyg som går bortom begränsningarna hos dagens amplifikationsberoende metoder. Här rapporteras en innovativ, amplifikationsfri CRISPR/Cas12a-analys (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein) integrerad med osmotiskt justerbara dubbel-emulsionsdroppar (DE-droppar) för snabb och ultrasensitiv upptäckt av gendopning.

Mål-DNA och CRISPR/Cas12a-komplex kapslas in i DE-droppar, där osmotisk krympning snabbt koncentrerar reaktionskomponenterna och därmed förstärker fluorescenssignalens intensitet utan nukleinsyraamplifiering. Denna plattform möjliggör detektion av den mänskliga erytropoietingenen (hEPO) på tidigare oöverträffade attomolära nivåer inom 30 minuter, med en 25-faldig förbättring av känsligheten jämfört med icke-krympbara format.

Anmärkningsvärt nog visade analysen en robust och specifik prestanda i komplexa serumprover med minimal matriseffekt. Detta nya tillvägagångssätt erbjuder en snabb, tillförlitlig och i grunden kontaminationsfri lösning för övervakning av gendopning, med bred potential för mångsidig, amplifikationsfri nukleinsyradiagnostik.

GENDOPING AV DJUR

Gendoping avseende hästar

I föreliggande forum diskuteras i första hand doping avseende idrottsutövare. Här tas emellertid en aktuell artikel om hästdoping upp eftersom den ger en bra översikt över dopingens aktuella möjligheter – och med baktanken att man kan experimentera mer med hästar än med människor och därför har data som inte (ännu?) är tillgängliga avseende människor.

Genterapi är fortfarande ett område under utveckling, och nyare studier visar lovande och positiva effekter; dock skapar tekniken också utrymme för illegal användning av genterapi i syfte att förbättra tävlingshästars prestation, vilket är förbjudet. Motiv för missbruk kan vara ekonomiska, och som exempel genererade hästkapplöpningar i Storbritannien en årlig omsättning på 3,5 miljarder pund.

Det är värt att nämna att hästar används som modell i forskning kring genterapi för människor. På grund av deras livslängd och större anatomiska egenskaper, som leder, är de lämpliga djurmodeller för utveckling av sådana behandlingar. Området är även relevant för hälsan hos hästsportens atleter, och kartläggningen av hästens genom år 2006 har möjliggjort bättre genomsökningar. Dessa fynd har lett till ökad förståelse för specifika gener som är kopplade till hästars idrottsprestationer.

WADA definition av gendoping

WADA har genom åren utvecklat sin definition av gendoping. Den avgränsning som gäller 2025 Är: ”Användning av nukleinsyror eller analoger till nukleinsyror som kan förändra genomsekvenser och/eller förändra genuttryck genom vilken mekanism som helst. Detta inkluderar, men är inte begränsat till, edigering av gener, gensilencing (avstängning av genuttryck), och gentransfertekniker.”

Inte bara WADA utan också Internationella Förbundet för Galoppsport (IFHA) och Internatio-nella Ridsportförbundet (FEI) har förbjudit gendoping. För närvarande är genterapi i hästsporten sålede förbjuden av regelverk, men den terapeutiska effekten av genterapi har bevisats för både artros (OA) och skador på ytliga böjsenan (SDFT).

Genterapitekniker

Genterapi är en lovande behandlingsmetod vid vissa sjukdomar eftersom den kan modulera genuttryck och förändra gener. En metod är att injicera en gen (en så kallad transgen) i en “budbärare”, till exempel en viral vektor eller plasmid. De mest använda vektorerna är virus, eftersom de kan föra in den önskade genen i mottagarens genom. Retrovirus kan föra in gener i kromosomer, medan adenovirus inte kan det.

Beroende på vilken viral vektor som används, finns det olika fördelar såsom:

långvarig terapeutisk effekt

möjlighet att rikta in sig på specifika celler

stor genetisk lastkapacitet

Dock kan införandet av ett virus medföra:

oönskade immunreaktioner

celltoxicitet

risk att påverka redan existerande gener i genomet

Ett alternativ till virus är användning av icke-virala bärare, såsom plasmid-DNA eller kemi-kalier, till exempel lipider i form av liposomer. Dessa har lägre toxicitet, men också lägre effektivitet. På senare år har dock lipid-nanopartiklars effektivitet utvärderats, och de har visat sig vara framgångsrika i att leverera önskat genetiskt material, även om det finns utmaningar såsom vävnadsspecifik upptagning eller nedbrytning i kroppen.

En oro kring kemiska bärare är att de kan reagera med icke-målceller, till exempel reagerar liposomer med lipoproteiner. Detta kan motverkas genom att tillsätta polyetylenglykol (PEG), vilket förhindrar att liposomens yta interagerar med andra ämnen.

Det finns även mekaniska metoder, såsom elektroporation, där elektriska impulser skapar porer i cellmembranet, vilket tillåter att önskade ämnen förs in i cellen. Det övergripande målet med att introducera en främmande gen är ofta att producera ett specifikt protein.

En annan genintervention görs genom genredigering (Clustered Regularly‐Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR–Cas9), Transcription Activator‐Like Effector Nucleases (TALEN) eller zinkfingernukleaser (ZFN)), vilket är en mer avancerad teknik som innebär att genetiskt förändra ett embryo eller ägg för att få önskat modifierat avkomma. Interventionen kan innebära att rikta in sig på specifika gensekvenser, ta bort eller lägga till nya gener – och denna typ av förändring går i arv till avkomman. Modifieringarna kan införas i organismen in vivo eller ex vivo:

In vivo: Transgenen förs in i mottagarens celler där den uttrycks

Ex vivo: Förändringen sker utanför organismen, och den modifierade produkten transplanteras sedan till den önskade platsen för transgenuttryck i mottagarens kropp

I de flesta studier som använt gentransfermetoder var administrationsvägen intraartikulär – direkt till skadeområdet – men vissa studier har också använt intramuskulära injektioner.

Potentiella användningsområden för gendoping hos hästar

Gener för träningsanpassning

Forskning har identifierat flera gener som är involverade i anpassning till träning, genom att studera globalt mRNA-uttryck i skelettmuskulatur efter löpbandsträning. Biopsier från musculus gluteus medius tagna 4 timmar efter träning visade ökat uttryck av 932 gener.Dessa gener påverkar främst aktincytoskelettet, MAPK-signalvägar (som styr cellproliferation och differentiering), samt insulinsignalering och mTOR-vägar – alla viktiga för muskelanpass-ning till fysisk belastning.

Gener för muskelmassa

Gener som påverkar muskelmassa – en nyckelfaktor för atletisk förmåga – är potentiella mål för manipulation. Ett exempel är myostatin-genen (MSTN), vars uttryck har stor påverkan på skelettmuskulaturens massa. Genom autokrin eller parakrin signalering hämmar MSTN muskeltillväxt och begränsar antalet och storleken på muskelfibrer. Blockering av denna gen är ett potentiellt mål för gendoping eftersom det skulle stimulera muskeltillväxt.

Forskning har dessutom visat att vissa varianter av MSTN-genen är kopplade till hästars optimala tävlingsdistanser. I en ny studie lyckades man skapa ett MSTN-knockout-embryo hos häst med hjälp av somatisk cellkärnöverföring och CRISPR/Cas9.

Dessutom har glykoproteinet follistatin, som hämmar uttrycket av MSTN, visat sig främja muskeltillväxt hos både möss och makaker. Det är dock ännu oklart om manipulation av follistatin-genen skulle förbättra tävlingsresultat hos hästar, även om forskning på människor visat att anabola steroider ökar follistatinnivåerna.

Insulinliknande tillväxtfaktor‐1

Insulinliknande tillväxtfaktor-1 (IGF-1) påverkar muskelmassa och styrka. Den hämmar inte bara MSTN, utan främjar även celltillväxt och proteinsyntes. I studier på möss visade genterapi med IGF-1 cirka 15 procents ökning i muskelmassa utan någon ytterligare träning. I kombination med träning nådde ökningen cirka 30 procent. När träningen avbröts visade det sig att muskelförlusten gick långsammare, vilket kan vara relevant för att motverka muskelförlust hos hästar som har träningsuppehåll. Det har föreslagits att IGF-1, interleukin-1-receptorantagonist (IL-1ra) och matrixmetalloproteinas 2 (MMP2) är lämpliga biomarkörer för tidig upptäckt av skaderisk hos hästar; dock har endast basnivåer av IGF-1 värde som markörer för konditionsstatus hos galopphästar.

Gener som påverkar muskelkontraktion

ACTN3-genen, som kodar för det sarkomeriska proteinet alfa-actinin-3, är avgörande för snabb muskelkontraktion i typ II-muskelfibrer. Den påverkar också anpassningen till träning samt glykogenmetabolismen i musklerna. Det finns polymorfismer i ACTN3-genen – till exempel tror man att en enskild nukleotidpolymorfism (SNP) hos människor avgör uthållig-hetsegenskaper kontra sprinterförmåga. Sådana SNP:er har ännu inte identifierats hos hästar, men en studie har lokaliserat SNP:er som kan påverka atletisk prestation. Med genetisk teknikutveckling kan detta bli ett framtida mål för doping såväl som en biomarkör för prestationspotential.

Tillväxthormon

Somatropin (tillväxthormon, GH) stimulerar proteinsyntes och muskelväxt och har miss-brukats inom mänsklig idrott. Trots att nyare studier visat att användning hos friska individer inte signifikant förbättrar prestationen, kan det fortfarande vara ett mål för gendoping på grund av de kända effekterna. År 1992 föreslogs en rekombinant form av häst-GH (reGH) för att förbättra kvävebalansen hos äldre hästar, men det visade ingen påverkan på prestation. Det finns väletablerade metoder för att upptäcka användningen av dessa substanser och inga rapporter om missbruk har förekommit.

Syretransport och erytropoes-gener

Hög maximal syreupptagningsförmåga, som förbättrar syretransporten i kroppen, påverkar idrottsprestationen. Detta inkluderar hemoglobinets transport av syre i blodet vid ökat vävnadsbehov under träning. Syretransportförmågan är ett potentiellt mål för gendoping. Tidigare har det rapporterats om missbruk av erytropoetin (EPO) hos människor, och både det och relaterade former som darbepoetin är förbjudna inom idrotten. EPO produceras av celler i njurarna och stimulerar blodbildning genom att binda till receptorer i benmärgen. Ett vektorplasmid med EPO presenterades 2003 men drogs snabbt tillbaka. Det finns inga bekräftade rapporter om missbruk inom hästsport, och det skulle troligen orsaka en immunologisk reaktion hos hästar. Men genetisk manipulation av EPO är fortfarande en möjlighet.

Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) deltar i uttrycket av gener som ansvarar för inte bara erytropoes, utan även angiogenes, mitokondriell biogenes och glukosmetabolism – vilket gör det till ett perfekt mål för gendoping, eftersom alla dessa processer påverkar prestations-förmågan. Till exempel, ju fler mitokondrier det finns i musklerna, desto mer syre kan utnyttjas. Syrebrist inducerar uttrycket av HIF-1, vilket i sin tur ökar transkriptionen av vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF). Studier har visat en signifikant ökning av VEGF efter träning. VEGF främjar också angiogenes, vasculogenes och tillväxt av endotelceller, vilket bidrar till fysisk prestationsanpassning.

Prestandarelaterade polymorfismer

Litteratur visar att polymorfismer i vissa gener kan påverka prestationsförmåga, inklusive CK (kreatinkinas, muskel), COX4I2 (cytokrom c-oxidas, subenhet 4, isoform 2), med starkt stöd för genen PDK4 (pyruvatdehydrogenaskinas, isoenzym 4). COX4 deltar i mitokondriell andning och ATP-produktion. Dess uttryck ökar i hästens skelettmuskler under fysisk aktivitet och påverkar prestationen positivt. CK är involverat i ATP-fosforyleringsvägar och vissa fosfageners metabolism. Ett experiment på CK-knockoutmöss visade att det förbättrade deras uthållighet. PDK4 påverkar glukosmetabolism och reglerar fettsyraoxidation, som används för mycket effektiv ATP-produktion (beta-oxidation). Forskning har visat samband mellan två SNP:er inom PDK4-genen och tävlingsprestation hos hästar.

Peroxisome proliferator‐activated receptors

Gener som kodar för peroxisomproliferatoraktiverade receptorer (PPAR) verkar spela en stor roll i träningskapacitet, eftersom PPAR reglerar gener som påverkar fettsyraoxidation och glukosmetabolism. Det finns rapporter som stödjer att PPAR-alfa har angiogenesfrämjande effekter i samverkan med VEGFB, och PPAR-delta föreslås vara en markör för potentiell uthållighet hos hästar, med tanke på dess ökade uttryck under fysisk aktivitet.

Fenotypmodifiering

Det önskade kapplöpningshäst-fenotypen har under många år förfinats genom avel, och hos fullblodshästar är snabbhet en särskilt eftertraktad egenskap. Studier har spårat kvantitativa locus (QTL) som påverkar egenskaper såsom vikt och mankhöjd, och som nämnts tidigare påverkar MSTN-genen muskelmassan. En studie av visade att införandet av korta inter-spererade nukleära element (SINE) minskar uttrycket av MSTN och därmed påverkar muskelutvecklingen. En annan gen som kan bli mål för genmanipulation är TBX15 (T-box transkriptionsfaktor), som inte bara påverkar skelettutveckling utan också differentiering av muskelfibrer. Vissa källor pekar på ett samband mellan dålig exteriör och ökad skaderisk.

Flera studier har föreslagit att pälsfärg inte påverkar tävlingsprestationer hos hästar. Det finns dock vetenskapliga rapporter om att vissa genlocus som styr pälsfärg också är inblandade i patologiska tillstånd. Exempelvis är lavendelfölssyndrom hos arabiska föl kopplat till en pälsfärgsutspädning som associeras med en dödlig deletionsmutation i myosin 5A-genen.

Påverkan på sjukdomskänslighet

Gendoping har potential att minska sjukdomskänslighet genom att rikta in sig på olika gener. Det har visats att skador på den ytliga böjsenan (SDFT) involverar mikroskador och ökat uttryck av MMP-1-genen (kollagenas-1). Ökat uttryck av MMP-1 förekommer också vid artros (OA), vilket är vanligt bland kapplöpningshästar. En studie på en musmodell för OA visar att genterapi med ett adenovirus som uttrycker proteoglykan 4 (PRG4) kan förhindra utvecklingen av OA hos äldre individer. IGF-1 påverkar syntesen av proteoglykaner och stimulerar bildning av kollagen typ II, medan interleukin-1-receptorantagonist (IL1RN) kodar för IL-1ra. IL-1ra fungerar som en hämmare av interleukin-1 och har använts som ett antiinflammatoriskt medel vid ledsjukdomar, med potential att behandla kliniska symtom och påverka utvecklingen av traumautlöst artros. I en klinisk studie användes plasmid-DNA som kodar för två terapeutiska, artsspecifika tillväxtfaktorer – VEGF164 och fibroblasttillväxtfaktor 2 (FGF2) – med framgång för att behandla tendinit i SDF och ligamentskador i gaffelbandets grenar.

Direkta detektionsmetoder

Direkta detektionsmetoder fokuserar på PCR-testning, medan indirekta metoder syftar till att upptäcka produkter av geninterventioner, såsom proteiner, RNA och metaboliter. Den största utmaningen med att detektera sådana förändringar är att kunna särskilja endogena mole-kyler från de som kommer från transgener. För att analysera transgena proteiner eller meta-boliter föreslår litteraturen att man använder ELISA eller masspektrometri. Transgener är något lättare att identifiera eftersom de saknar intronregioner i DNA:t. PCR-metoder är baserade på detektering av unika exon–exon-övergångar i transgener. En utmaning med denna metod är risken för att pseudogener i värdgenomet kan ge upphov till falska positiva resultat vid identifiering av transgener.

Analys av hårprover

Det har identifierats en möjlighet för framtida strategier för att upptäcka gendoping: man har visat att tagel kan användas för genomscreening. Den största fördelen med hår är att det kan bevaras i upp till tio år och är ett praktiskt provmaterial. Dessutom framstår det som ett attraktivt alternativ för kontroll av genetiskt modifierad avkomma, eftersom varje förändrat genom skulle kunna detekteras i håret. Hela genomet kan även sekvenseras från blodprov, men hårprover har obestridliga fördelar eftersom de kan samlas in av vem som helst, till skillnad från blodprov som måste tas av en veterinär och är svårare att transportera.

Hårprover är hållbara och underlättar lagring av data för ett WGR-bibliotek (Whole Genome Resequencing) samt för att jämföra genomet mellan förälder och avkomma för att upptäcka genredigering i embryon.

Detektion av transgener med mikrofluidisk kvantitativ PCR (MFQPCR)

Man har påvisat 12 transgener som möjliga mål för gendopingsmissbruk med hjälp av MFQPCR-metoden (microfluidic quantitative polymerase chain reaction). Dessa 12 gener, som alla diskuterats tidigare, var: GH1, IGF1, EPO, MSTN, FST, ZFAT, FGF2, VEGF, CKM, PCK1, PDK4 och PPARD. Studien etablerade MFQPCR som en effektiv metod för screening av dessa gener, och det är troligt att metoden kan anpassas för att upptäcka andra transgener genom att utveckla nya primers och prober.

Droplet Digital PCR-teknik (ddPCR)

Droplet digital PCR (ddPCR) har utvärderats för detektering av gendoping hos hästar. Metoden var effektiv i att upptäcka minst 130 kopior av EPO-transgenen i 1 ml plasma och 200 kopior i urin. Samma metod skulle potentiellt kunna användas för identifiering av IGF1 och FST. Liknande resultat erhölls när EPO infördes i en plasmidvektor och ddPCR effektivt detekterade den främmande genen i blodprover från infekterade “micromini”-grisar (modeller i studien).

Multiplex PCR för gendetektion

Det har visats att multiplex PCR har utmärkt specificitet och hög känslighet. Fem definierade transgener kunde upptäckas i en enda analys.

Bekräftelsetest med PCR och sekvensering

Att kombinera PCR-amplifiering och DNA-sekvensering med specifika primers och promotorer riktade mot vissa transgener gör det möjligt att utesluta falskt positiva resultat. Det finns dock utmaningar med PCR-metoder – endast ett fåtal kända målgener kan detekteras i en reaktion, och små förändringar i transgenens design kan förhindra PCR-amplifiering.

Andra PCR-baserade metoder

Det har använts massivt parallell sekvensering med tvåstegs-PCR för att samtidigt rikta in sig på flera transgener med hjälp av flera uppsättningar primers. En annan intressant metod är användningen av split-read och paired-end-algoritmer i en metod kallad DELLY, som detekterar genetiska omarrangemang. Det har visats att DELLY effektivt kan identifiera vissa transgener.

Indirekta detektionsmetoder

Mätning av immunologiskt svar

Det finns flera möjliga tester för att upptäcka gendoping hos människor. En av dem är att mäta kroppens immunologiska svar på en virusvektor. Hästar exponeras dock ofta för adeno-associerade virus, vilket resulterar i produktion av neutraliserande antikroppar (NAbs) som kan störa immunologisk detektion av virusvektorer. Därför har denna metod ännu inte använts för att upptäcka gendoping hos hästar.

Biologiska pass för hästar

En annan möjlighet till indirekt detektion bygger på konceptet med ett biologiskt pass för hästar (Equine Biological Passport, EBP). Genom att longitudinellt följa specifika biologiska markörer kan otillåtna genetiska modifieringar avslöjas över tid. Detta görs genom att etablera genetiska baslinjeprofiler, regelbundet följa upp biologiska värden, använda avancerad genomisk analys och integrera data i en central databas för att övervaka eventuella förändringar orsakade av exempelvis gendoping. Vissa tävlingsmyndigheter har redan påbörjat utvecklingen av EBP.

Etiköverväganden

Det finns allvarliga etiska farhågor kring gendoping och dess potentiella påverkan Människor har emellertid avlat hästar för att få bästa möjliga avkomma i århundraden. Är direkt genetisk förändring verkligen så annorlunda från det som redan praktiserats genom selektiv avel?

För det första är noggrannheten i dessa metoder osäker. Till exempel kan CRISPR-tekniken lätt leda till inexakta resultat, såsom så kallade “off-target-effekter”, som kan orsaka skador eller mutationer i DNA med okända konsekvenser för djuret. Genetisk förändring har potentiellt okända effekter på individnivå – vissa kan ha tur, andra otur. Misslyckad integration av en transgen kan också framkalla cancerutveckling. Det finns många faktorer som påverkar genuttryck, inklusive miljömässiga modulatorer, vilket potentiellt kan leda till olika utfall av genförändringar hos olika individer.

Gendoping påverkar sportens integritet negativt genom fusk som underminerar fair play och ryttarsportens trovärdighet. Detta skulle i sin tur minska allmänhetens stöd för hästsporten, vilket kan få katastrofala ekonomiska konsekvenser för branschen. Inom människosport är det idrottaren själv som väljer om hen vill delta eller inte – ett djur kan inte ge sitt samtycke, vilket ur etisk synvinkel redan är problematiskt när det gäller att använda djur för mänsklig underhållning, såsom tävlingar. Naturlig avel ger en balans där vissa individer är mer lämpade för tävling än andra, vilket gör det möjligt för hästar att existera i enlighet med sina förutsättningar och predispositioner.

Reglering och anti-dopingsinsatser

IFHA (International Federation of Horseracing Authorities) har uttalat att:

Ämnen som när som helst kan direkt eller indirekt orsaka en verkan eller effekt, eller en verkan och effekt på genuttryck i en däggdjurskropp. Detta inkluderar, men är inte begränsat till, genredigeringsverktyg med kapacitet att förändra genomsekvenser och/eller transkriptionell, posttranskriptionell eller epigenetisk reglering av genuttryck

Upptäckt av sådana ämnen leder till diskvalificering och konsekvenser för den inblandade personalen.

IFHA har även deklarerat att genterapi endast är acceptabel efter godkännande från tävlingsmyndigheten och endast för behandling av sjukdom eller skada diagnostiserad av veterinär, samt om följande villkor uppfylls:

Inte kan förändra hästens ärftliga genom

Inte utgör ett hot mot hästens välfärd

Inte hotar tävlingsintegriteten, varken genom att förbättra eller försämra en hästs prestation i lopp

År 2017 bildade IFHA Gene Doping Control Sub-committee för att definiera genterapi och dess missbruk inom galoppsporten. Även om IFHA gjort stora framsteg i att adressera gendoping finns ännu inga specifika detektionskriterier.

Samtidigt publicerade WADA (World Anti-Doping Agency) “Guidelines on Gene Doping Detection” år 2021, där de angav att direkta PCR-baserade analytiska metoder är det föredragna laboratorieverktyget. Myndigheter världen över har erkänt vikten av harmonisering och reglering vid utveckling av antidopingsstrategier. Som ett resultat angav IFHA redan 2012 att ett av huvudmålen för perioden 2012–2015 var:”harmonisering av regler och harmonisering av medicinkontroll”.

I målen för perioden 2020–2023 anges att ett fokusområde ska vara samarbete med Gene Doping Control Sub-committee för att förbättra kontrollen och upptäckten av gendoping. Ett officiellt samarbete med WADA inleddes år 2019, vilket starkt rekommenderades av antidopingsförespråkare.

Samarbete mellan reglerande organ, veterinärer, forskare och intressenter är avgörande för att utveckla effektiva strategier mot gendoping. Reglerande organ måste samarbeta med forskare som arbetar med att utveckla de mest träffsäkra detektionsmetoderna. Ett exempel på detta var AORC Gene Doping Workshop 2019, där genterapi och gendoping diskuterades av forskare, veterinärer, läkare och världsledare från 12 olika länder. Sådana initiativ säkerställer gemensamma insatser för att bekämpa de nya utmaningarna inom sportvärlden.

Den allmänna uppfattningen om hästdoping

Allmänhetens åsikt om dopning av hästar utvärderades i en onlineundersökning som visade att 54 procent av deltagarna var oroliga för potentiell användning av gendopning inom hästkapplöpning och såg det som ett hot mot hästvälfärden. Undersökningen visade att människor värderar både sportens etik och omsorgen om djurens välfärd. Sju av tio yngre deltagare uttryckte oro över riskerna för hästarnas hälsa. Nästan 83 procent av de yngre respondenterna uttryckte tvivel kring etik inom hästsport och tveksamhet att stödja sporten som en följd.

Hästsportens framtid är i hög grad beroende av det så kallade “Social Licence to Operate” (Socialt tillstånd att verka) och av engagemanget från en allmänhet som prioriterar välfärden för hästsportens atleter och transparens. I en brittisk undersökning svarade endast 18 procent att om kommunikationen och djurvälfärden förblir på nuvarande nivå, kommer hästkapplöpning fortsatt att vara acceptabel.

Framtidsperspektiv

För närvarande finns de flesta rapporter om genterapi hos hästar inom ramen för experimen-tella studier, även om terapin har potentiella kliniska tillämpningar. Inom humanmedicinen finns det februari 2025 22 godkända in vivo- och ex vivo-produkter för genterapi. De största framtida utmaningarna med sådana behandlingar rör deras säkerhet, effektivitet och specifi-citet. Det finns problem relaterade till val av vektorer – vissa utlöser besvärliga immunsvar, medan andra inte är effektiva. Regulatoriska och etiska frågor kring dessa potentiellt lovande behandlingar återstår att hantera.

Arbetet med att upptäcka gendopning går snabbt framåt. Man har utvecklat en CRISPR/Cas-baserad metod för att identifiera gendopning, i linje med en metod som föreslagits för att upptäcka EPO-gendopning hos människor. Trots sina nyttiga tillämpningar skulle CRISPR-metoden även kunna användas för att förbättra atleters prestationsförmåga.

Metoden “Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing” (SHERLOCK) har potential att i framtiden användas som ett test för dopningskontrollprover.

I dagsläget finns det inga offentligt bekräftade fall av gendopning hos hästar i dressyr, trav eller galopp, och förekomsten av sådana metoder inom ridsporten är fortfarande okänd. Den relativt nya utvecklingen och implementeringen av avancerade metoder för att upptäcka gendopning kan emellertid innebära att omfattande tester ännu inte genomförts i tillräcklig utsträckning för att avslöja eventuellt missbruk. Dock arbetar idrottsmyndigheter och forskare intensivt med att etablera nya och tillförlitliga metoder för att upptäcka gendopning. Etiska debatter pågår och efterlyser sammanhållning och enighet inom sportvärlden för att möjliggöra framtagandet av tydliga riktlinjer.

DIVERSE

WADA finansierar detektering av gendopning

WADA meddelade den 15 september 2025 att Dr Daniel Hershtain, chef för Israels nationella antidopningsbyrå, har påbörjat ett samarbete med ledande forskare inom genetik – professorerna Kyle Cromer och Shai Carmi – för att utveckla en känslig, skalbar och icke-invasiv metod för att upptäcka genredigeringar kopplade till dopning.

Cromer vid University of California, San Francisco, är expert på terapeutisk genomeditering och genbaserade interventioner, och Carmi vid Hebreiska universitetet i Jerusalem är en ledande forskare inom statistisk och populationsgenetik med banbrytande arbete inom medicinsk genomik. Med Hershtain som styr projektet mot de praktiska behoven inom global antidopning har gruppen nyligen tilldelats ett forskningsanslag från Världsantidopningsbyrån (WADA).

I takt med att dopningsmetoder blir alltmer sofistikerade vill WADA ligga steget före genom att finansiera banbrytande forskning om ny teknik som kan hjälpa idrottare att tänja gränserna för mänsklig prestation. När det gäller gendopning – att förändra sin genetiska uppsättning för att förbättra egenskaper som muskelmassa eller antalet röda blodkroppar – är det dock annorlunda. Metoden har funnits på WADA:s lista över förbjudna substanser och metoder sedan 2003, och organisationen har länge efterlyst detektionsstudier, även om inga bekräftade fall ännu finns.

Liksom många vetenskapliga genombrott kan genterapi – som ofta betraktas som ”den heliga graalen” inom medicinen – användas i icke-terapeutiska syften av idrottare som hoppas slå systemet. Till skillnad från traditionella dopningsmetoder, som kräver upprepade doser för att upprätthålla substansnivåer, kan gendopning vara en engångsbehandling i form av en injektion med DNA-förändrande protein. Och till skillnad från prestationshöjande läke-medel som lämnar spår kan genterapi än så länge undgå upptäckt i vanliga dopningstester.

Ett jämförande exempel är erytropoietin. Även om substansen endast kan upptäckas under en kort tidsperiod i urin eller blod, riskerar idrottare ändå att åka fast vid regelbundna tester både i och utanför tävling. Med genterapi kan man förändra genen som producerar erytropoietin i kroppen, eller genen för dess receptor, Detta innebär att en idrottare inte behöver ta hormonet, eftersom kroppen själv kommer att producera effekten.

Till skillnad från tidigare metoder, som bara kunde upptäcka gendopning efter 56 dagar, arbetar det nya teamet med att retroaktivt kunna avslöja manipulationer. Teamet arbetar på en lista för att avgränsa de mest troliga målgenerna. Förutom att öka antalet röda blodkroppar för bättre syretransport till musklerna kan ökad muskelmassa och bentäthet vara andra tänkbara mål för manipulation.

Även om intag av prestationshöjande läkemedel redan är riskfyllt varnas nu för att gendopning kan vara ännu farligare, eftersom DNA-strukturen förändras permanent. Till skillnad från läkemedel, som individen kan sluta ta, innebär detta att biverkningar blir mycket svårare att behandla – och de kan inkludera cancer, organskador och till och med död.

REFERENSER