Att skilja mellan exogena och endogena steroider

Tillförsel av naturliga androgener (testosteron, T, eller dihydrotestosteron, DHT) eller pro-androgener (androstenedion, DHEA) medför problemet att skilja mellan exogena och endogena steroider. Exogen tillförsel av testosteron kan upptäckas genom urinens T/E-kvot, dvs. förhållandet mellan testosteron (T) och dess 17alfa-epimer epitestosteron (E), som fungerar som ett känsligt screeningtest.

Hos män utsöndras både T och E samtidigt från Leydigcellerna och utsöndras konsekvent i urinen, vilket gör att urinens T/E-kvot vanligtvis är stabil över tid för varje individ och typiskt ligger runt 1. Tillförsel av exogent testosteron, som inte omvandlas till E, leder till en ökning av urinens T/E-kvot. När denna överstiger ett fastställt gränsvärde utgör det evidens för tillförsel av exogent testosteron.

Gränsvärdena för urinens T/E-kvot var ursprungligen populationsbaserade och sattes först till 6, för att senare sänkas till 4. Urinens T/E-kvot är dock inte ett effektivt screeningtest för testosterondopning hos kvinnor. Detta beror på att cirkulerande testosteron hos kvinnor, till skillnad från hos män där testosteron huvudsakligen härrör från en enda källa under stark negativ hypotalamisk feedback, kommer från tre steroidogena källor (binjure, äggstock och extraglandulär omvandling), vilka ingen står under stark negativ feedback av testosteron.

Dessutom utgör risken för falskt negativa och falskt positiva resultat med populations-baserade gränsvärden en begränsning, vilket kan kräva ytterligare analyser för att bekräfta eller avfärda testosterondopning i enskilda fall. Dessa överväganden har lett till införandet av steroidmodulen i Idrottarens biologiska pass (Athlete Biological Passport, ABP), som består av upprepade longitudinella observationer av en individs analyser och skapar adaptiva, individ-specifika T/E-gränsvärden. Genom att ersätta populationsbaserade gränsvärden med personliga referensnivåer möjliggörs en mer känslig och exakt upptäckt av individuella avvikelser i urinens T/E-kvot som tecken på testosterondopning.

En begränsning med urinens T/E-kvot är en genetisk polymorfism i genen uridin-5′-difosfat-glukuronosyltransferas (UGT) 2B17, som kodar för ett leverenzym i fas II-metabolismen och som glukuroniderar testosteron, vilket gör det mer hydrofilt och underlättar utsöndring i urinen. Polymorfismen består av en genetisk deletion som hos homozygoter ger ett icke-funktionellt enzym, vilket reducerar utsöndringen av testosteron (men inte epitestosteron) i urinen till nära noll och därmed ger en extremt låg T/E-kvot (<0,1).

Även om denna genetiska polymorfism i testosteronmetabolism och utsöndring inte tycks ha någon biologisk effekt på testosteronets verkan, är den ojämnt geografiskt fördelad och betydligt vanligare i sydostasiatiska populationer. Denna biologiskt betingade falskt negativa effekt innebär att sannolikheten att upptäcka tillförsel av exogent testosteron via urinens T/E-kvot är kraftigt reducerad och ofta inte överstiger populationsbaserade gränsvärden (68). Däremot kommer den att överstiga individens egna person-specifika T/E-gränsvärde, vilket gör att genotypning och/eller bayesiansk profilering av seriella T/E-värden inom ABP-programmet ger kompletterande evidens. Användning av steroidmätningar i blod kan dessutom övervinna de diagnostiska svårigheter som orsakas av UGT2B17-polymorfismen.

Tillämpningen av dried blood spot-provtagning (DBS) och analys utgör ett viktigt framsteg inom antidopningsvetenskapen. Metoden möjliggör enkel och minimalt invasiv kapillär blodprovtagning utan behov av venpunktion, frysförvaring eller transport av frysta prover till laboratorium. Olika volymetriska provtagningsenheter finns numera tillgängliga; de är smärtfria men relativt kostsamma. DBS kan användas för att upptäcka bloddopning samt användning av EPO, tillväxthormon (GH) och deras sekretagoger.

En vidareutveckling av ABP:s longitudinella profilering med en bayesiansk metod, där alla tidigare data sammanvägs till individbaserade snarare än populationsbaserade prediktioner, har utvecklats för blodsteroider i kombination med urinbaserad steroidprofilering, inklusive användning av DBS-provtagning.

Administrering av exogent testosteron kan även identifieras med kolisotopkvots-masspektrometri (CIRMS), som kan skilja endogent från exogent testosteron baserat på förhållandet mellan 13C/12C i urinens testosteron. Kommersiellt tillverkade steroider produceras från växtsteroler som bildas genom fotosyntes och uppvisar en markant lägre 13C/12C -kvot (vanligen −26‰ till −36‰ relativt global standard) jämfört med däggdjurs egen testosteronbiosyntes (−16‰ till −26‰). En signifikant sänkt (”utarmad”) 13C/12C -kvot i urinens testosteron, som överstiger 3‰ relativt endogena referenssteroider, indikerar därför att testosteronet åtminstone delvis har exogent ursprung från kemisk syntes av växtsteroler.

CIRMS kan även användas för att upptäcka tillförsel av andra naturliga androgener eller pro-androgener, inklusive DHT och DHEA (82), androstenedion, nandrolon eller till och med försök till maskering genom administrering av epitestosteron (för att sänka urinens T/E-kvot). Ett fåtal testosteronprodukter (<5 %) har nyligen framkommit med en lägre, mer däggdjurslik 13C/12C -kvot, vilket innebär en utmaning för CIRMS-detektion. Utökad isotopprofilering av andra steroidprekursorer och metaboliter ger dock ytterligare kompletterande referensbiomarkörer.

En longitudinell tillämpning av CIRMS, i linje med en ytterligare modul inom ABP, har föreslagits och utvärderats. Vidare har utvecklingen av väteisotop-masspektrometri ytterligare förbättrat möjligheten att skilja mellan endogena och exogena steroider även när kolisotopkvoten inte är informativ. Suppression av luteiniserande hormon (LH) i urin eller serum kan också ge stödjande evidens för användning av exogent testosteron eller andra syntetiska androgener.

Även om masspektrometri (MS) är mycket effektiv för att upptäcka specifika androgener, kräver metoden kännedom om den kemiska struktur som ska detekteras och kan annars inte tillämpas. Denna begränsning gäller för såväl aldrig marknadsförda designerandrogener som nutraceutiska androgener som säljs via internet eller förekommer i oreglerade receptfria kosttillskott med odeklarerat steroidinnehåll.

En möjlig lösning är moderna in vitro-androgenbioanalyser som integrerar den humana androgenreceptorn tillsammans med en praktisk transaktiveringsbaserad kemisk utsignalsmekanism i värdceller av jäst eller däggdjur. Dessa analyser har en generell kapacitet att detektera alla bioaktiva androgener, oavsett kemisk struktur, genom deras direkta aktivering av androgenreceptorn. Konstruerade in vitro-androgenbioanalyser uppvisar en känslig dos-respons-signal som är proportionell mot den bioaktiva androgenens styrka.

Jästbaserade värdceller har hög specificitet för att detektera androgener men är mindre känsliga än däggdjursceller, vilka uttrycker naturliga steroida mekanismer, inklusive steroidogena enzymer och/eller andra steroidreceptorer. Däggdjursbaserade in vitro-androgenbioanalyser kan även detektera pro-androgener – steroider som saknar egen androgen bioaktivitet men som omvandlas till aktiva androgener inom däggdjurscellen. Därmed offrar däggdjursbaserade system viss specificitet till förmån för högre känslighet, samtidigt som de kan påvisa pro-androgener. Jäst- och däggdjursbaserade in vitro-androgenbioanalyser är därför komplementära vid detektion av både androgener och pro-androgener.

Begränsningarna med in vitro-androgenbioanalyser är deras känslighet för matriseffekter samt svårigheter att standardisera bioanalysbaserade tester. De lämpar sig därför bäst för att karakterisera produkter och substanser avseende androgen- eller pro-androgeninnehåll, snarare än för att detektera androgener i komplexa biologiska prover. Jästbaserad androgenbioanalys var exempelvis avgörande vid den första fällande domen för användning av en designerandrogen, genom att visa att tetrahydrogestrinon (THG) är en potent androgen. Metoden har även använts för att screena syntetiska gestagener och visa att, till skillnad från de ursprungliga androgen-deriverade gestagenerna, den moderna generationen gestagener inte är androgena.

Ytterligare, hittills relativt underutnyttjade, alternativ för att upptäcka androgendopning är användning av alternativa biologiska matriser såsom hår, hud och naglar samt saliv och utandningsluft. Hår har flera fördelar, inklusive minimalt invasiv provtagning, enkel och praktisk förvaring samt potential för mycket långa detektionsfönster, beroende på hårväxtens hastighet. MS-baserade metoder har rapporterats kunna detektera exogena och endogena androgener i mänskligt hår efter långvarig exponering, men inte efter engångsdosering. Håranalys har dock ännu inte genomgått den rigorösa standardisering och validering som krävs för att bli accepterad som antidopningstest i ett medicolegalt sammanhang. Kvarstående utmaningar inkluderar matriseffekter, låg återvinning, begränsad känslighet samt påverkan av ålder, hårfärg, alopeci, rakning och passiv kemisk (kosmetisk) kontaminering av håret. Även naglar och hud kan potentiellt ge liknande information om tidigare androgenexponering med relativt långa detektionsfönster, men tillräckligt robusta testmetoder har ännu inte utvecklats på ett övertygande sätt.

Salivprovtagning har också övervägts för antidopningstillämpning, analogt med använd-ningen av salivkortisol vid diagnostik av hyperkortisolism. Även om metoden potentiellt kan tillämpas för xenobiotiska läkemedel, är immunoanalys av testosteron i saliv inte tillräckligt tillförlitlig och lämpar sig inte för att upptäcka testosterondopning. Även mikroskopisk blodkontamination (till exempel gingivit, tuggning av hård föda eller tandborstning) kan ge onormalt höga värden. Förekomsten av sådana extremvärden gör salivbaserad testosteron-analys opålitlig för antidopningsändamål, eftersom den öppnar för påståenden om falskt positiva resultat vid varje avvikande fynd.

Analys av utandningsluft har också undersökts för vissa kemikalier med låg molekylvikt. Teoretiskt skulle androgeninducerat genuttryck i cirkulerande leukocyter kunna utgöra ytterligare en biomarkör för androgen effekt, förutsatt att specifika och reproducerbara signaturer kan definieras. Eftersom direkt detektion av androgener dock är möjlig och att föredra för att styrka en antidopningsregelöverträdelse återstår det att fastställa vilken roll genuttrycksbaserade biomarkörer för androgen verkan kan få inom antidopningsarbetet.

Referens: Handelsman DJ. Performance Enhancing Hormone Doping in Sport. 2025 Dec 22. In: Feingold KR, Adler RA, Ahmed SF, Anawalt B, Blackman MR, Chrousos G, Corpas E, de Herder WW, Dhatariya K, Dungan K, Hamilton E, Hofland J, Jan de Beur S, Kalra S, Kaltsas G, Kapoor N, Kim M, Koch C, Kopp P, Korbonits M, Kovacs CS, Kuohung W, Laferrère B, Levy M, McGee EA, McLachlan R, Muzumdar R, Purnell J, Rey R, Sahay R, Shah AS, Sperling MA, Stratakis CA, Trence DL, Wilson DP, editors. Endotext [Internet]. South Dartmouth (MA): MDText.com, Inc.; 2000–.