Gendopingdetektion baserad på DBS

Doping har fortsatt att utvecklas i takt med medicinska framsteg, och metoderna har blivit alltmer sofistikerade. Särskilt har genterapitekniken utvecklats snabbt. Denna teknik har lett till betydande genombrott i behandlingen av sjukdomar såsom muskeldystrofi, spinal muskelatrofi och hemofili. Men i takt med att tekniken utvecklas ökar också oron för gendoping inom idrotten. Därför valde WADA att uttryckligen inkludera gendoping i sin Förbudslista och att utöka sina övervakningsinsatser. Vår forskargrupp har undersökt metoder för att upptäcka denna form av doping i över sju år.

Ett av de mest oroande exemplen på gendoping är introduktionen av erytropoietingenen (EPO). EPO i form av rekombinant protein har länge missbrukats av idrottare i olika sporter för att förbättra uthålligheten. Samtidigt har det inom genterapiforskning nyligen rapporterats att rekombinanta adeno-associerade virus (AAV)-vektorer är mycket säkra, och många kliniska prövningar har genomförts. Denna bakgrund tyder på en hög risk att AAV-vektorer i kombination med EPO kan missbrukas för dopingsändamål. Detta understryker i sin tur hur brådskande det är att utveckla en metod för att testa hEPO-gendoping med hjälp av denna vektor.

Vid OS i Paris 2024 införde International Testing Agency (ITA) provtagning med torkad bloddroppe (DBS) för dopingtester och genomförde enligt uppgift analyser för gendoping. Eftersom de specifika metoderna inte har offentliggjorts är det dock möjligt att de fortfarande befinner sig i utvecklingsstadiet. Jämfört med traditionell blodprovtagning är DBS en minimalt invasiv teknik som kräver endast en liten mängd blod. Dessutom möjliggör DBS stabil förvaring i rumstemperatur utan behov av fryslagring, vilket avsevärt minskar logistik-kostnaderna. Av dessa skäl framstår DBS som ett rimligt verktyg för framtida tester av gendoping.

I takt med att detekteringsteknikerna utvecklas kvarstår minimering av kontamineringsrisken som en avgörande utmaning. Oavsett hur sofistikerade testmetoderna är kan felhantering av prover introducera kontaminanter och därmed riskera att idrottare felaktigt anklagas för doping. Ett sätt att minska denna risk är att automatisera provförbehandling och DNA-extraktion med hjälp av den humanoida laboratorieroboten (LabDroid) ”Maholo.” Vår forskargrupp har använt Maholo för DNA- eller RNA-extraktion och för att skapa bibliotek för nästa generations sekvensering (NGS). Denna robot är utformad för att hantera nukleinsyra-prover och kan utföra experiment automatiserat utan mänsklig inblandning, vilket kan bidra avsevärt till att förhindra kontaminering och oredlighet i laboratoriet. Dessutom kan roboten anpassas efter forskarnas behov, vilket gör den användbar inte bara för nukleinsyror utan även för andra tillämpningar. I praktiken har roboten automatiskt kunnat skapa inducerade pluripotenta stamceller (iPS-celler) och iPSC-härledda retinala pigmentepitelceller (iPSC-RPE). Vidare har vår forskargrupp framgångsrikt använt roboten inom veterinärmedicinsk forskning för att skapa DNA-bibliotek för NGS. Dessa faktorer tyder på att Maholo skulle vara särskilt fördelaktig vid tester för gendoping. Dessutom har vår forskargrupp utvecklat teknik för omfattande DNA-analys via bioinformatisk analys, vilken också potentiellt skulle kunna tillämpas vid tester för gendoping.” Mot denna bakgrund genomfördes denna studie för att utveckla en testmetod för gendoping med användning av torkad bloddroppe (DBS), NGS och LabDroid ”Maholo”.

Som ett första steg injicerades rekombinant adeno-associerat virus som innehöll den humana erytropoietingenen (hEPO) i möss för att etablera en gendopingmodell. Därefter skapades DBS med hjälp av helblod. Maholo användes för att extrahera DNA från DBS och för att skapa DNA-bibliotek för NGS. NGS i kombination med bioinformatisk analys identifierade tydligt DNA-fragment som gav otvetydiga bevis på gendoping i musmodellen, vilka saknades hos kontrollmusen.

Såvitt vi känner till är detta det första försöket att använda en biologisk modell av hEPO-gendoping i kombination med Maholo, NGS och DBS. Denna metod bör underlätta den fortsatta utvecklingen av testmetoder för gendoping.

Referens: Maehara K, Hirokawa A, Watanabe H, Otani N, Wan J, Shirai T, Takemasa T, Watanabe K, Nishi T, Sato K, Shimmura S, Nguyen KDM, Takahashi Y, Sugasawa T. Development of detection method using dried blood spot with next-generation sequencing and labdroid for gene doping control. Int J Mol Sci 2025; 26: 6129.