Kisspeptin är en neuropeptid och en kraftfull stimulator av den hypotalamiska–hypofysära–gonadala (HPG-)axeln. Genom att binda till den G-proteinkopplade receptorn KISS1R stimulerar den direkt frisättningen av gonadotropinfrisättande hormon (GnRH) till blodbanan, vilket i sin tur stimulerar frisättningen av luteiniserande hormon (LH) och follikelstimulerande hormon (FSH) från hypofysens framlob. Peptiden kodas av KiSS1-genen, som ursprungligen identifierades som en metastassuppressorgen vid malignt melanom. Upptäckten av genen i Hershey, Pennsylvania (USA), ledde till att den fick sitt namn efter de välkända choklad-pralinerna ”Kisses” som tillverkas där, medan ”SS” syftar på suppressor gene (suppres-sorgen). Idag är kisspeptin känt som en central regulator av puberteten, den könshormon-styrda frisättningen av gonadotropiner och den mänskliga fertiliteten.
Mot denna bakgrund har omfattande forskning bedrivits kring möjligheten att använda kisspeptin för behandling av hormonberoende störningar i sexuell och reproduktiv funktion, såsom hypotalamisk amenorré (HA), försenad pubertet och polycystiskt ovariesyndrom (PCOS), liksom vid hormonberoende cancerformer, exempelvis prostatacancer och bröst-cancer. Kisspeptin har också undersökts som biomarkör för dessa sjukdomar.
Strukturellt består kisspeptin av 54 aminosyror och har ett C-terminalt Arg–Phe–NH₂-motiv, vilket delas med flera andra neuropeptider. I blodcirkulationen klyvs kisspeptin (KP-54) vidare till peptider bestående av 14 (KP-14), 13 (KP-13) respektive 10 aminosyror (KP-10), vilka alla har samma amiderade C-terminal. Medan KP-13 endast har undersökts i prekliniska studier finns ett flertal kliniska studier där den terapeutiska potentialen hos KP-54 och KP-10 har utvärderats vid reproduktionsstörningar. Fokus har främst varit behandling av kvinnor med hypotalamisk amenorré, PCOS, assisterad befruktning (IVF) eller graviditetsrelaterade tillstånd.
Flera studier har visat att alla naturliga kisspeptiner inaktiveras relativt snabbt av matrix-metalloproteinaser, vilket delvis begränsar deras terapeutiska användning. Därför utvecklas och studeras ett växande antal syntetiska KISS1R-agonister med syftet att förbättra receptor-aktivering och metabolisk stabilitet genom modifiering av specifika aminosyror. Ett exempel är TAK-683, som har betydligt högre affinitet till receptorn än KP-54. När man upptäckte att substansen bildade gel i vattenlösning vidareutvecklades den till TAK-448, som innehåller flera icke-naturliga aminosyrasubstitutioner, däribland N-terminal acetylering, D-tyrosin, hydroxiprolin, aza-glycin och metylerat arginin. Därmed uppvisar substansen inte bara ökad farmakologisk aktivitet utan också avsevärt förbättrad stabilitet. TAK-448 (även kallad MVT-602) har därför redan studerats hos friska kvinnor med avseende på sina endokrinologiska effekter.
Kisspeptin och dess analoger är emellertid inte bara av kliniskt intresse utan även relevanta inom antidopingsområdet. Hos män leder stimuleringen av LH-beroende biosyntes och frisättning av testosteron till överfysiologiska nivåer av androgenet, vilket kan ge prestations-höjande effekter genom ökad muskelmassa och styrka. Därför kan kisspeptiner missbrukas av manliga idrottare i prestationshöjande syfte, och de inkluderades därför på World Anti-Doping Agency:s (WADA:s) förbjudna lista år 2024.
Detta ställer krav på tillförlitliga analysmetoder. Syftet med denna studie var därför att utveckla känsliga metoder för att detektera kisspeptin och dess analoger i dopingkontroll-prover med hjälp av vätskekromatografi kopplad till högupplösande masspektrometri (LC–HRMS). Med hänsyn till molekylernas storlek avsågs KP-54 analyseras i humana serum-prover, medan de mindre peptiderna (KP-14, KP-13, KP-10 och TAK-448) utvärderades i urinprover.
Eftersom tidigare studier visat att peptiderna har begränsad stabilitet i närvaro av serumproteaser genomfördes dessutom en omfattande undersökning av deras stabilitet i humant serum, plasma och urin. Målet var att identifiera nedbrytningsprodukter (metaboliter) som skulle kunna användas som kompletterande målsubstanser vid dopingskontroller och därmed förbättra möjligheten att upptäcka användning av dessa ämnen. Eftersom kisspeptiner i kliniska studier huvudsakligen administrerats genom subkutan injektion studerades dessutom deras metabolism i en human hud-S9-fraktion.
Även om LC-MS-baserade metoder för bestämning av kisspeptiner, exempelvis KP-10, tidigare har beskrivits, har endogena koncentrationer av kisspeptin hittills uteslutande bestämts med immunologiska metoder. Därför analyserades en referenspopulation bestående av serum- och urinprover från rutinmässiga dopingskontroller för att utvärdera de endogena nivåerna av kisspeptiner med hjälp av LC-MS-baserade analysmetoder.
För att möjliggöra en effektiv upptäckt av missbruk av kisspeptin krävs tillförlitliga analysmetoder. Syftet med denna studie var därför att utveckla metoder baserade på vätskekromatografi kopplad till högupplösande masspektrometri (LC-MS) för detektion av kisspeptin och dess analoger i humant serum och urin. Dessutom undersöktes peptidernas stabilitet i olika biologiska matriser, och deras metabola stabilitet karakteriserades in vitro.
Extraktionsmetoder baserade på katjonbytes-fastfasextraktion optimerades, vilket möjliggjorde en selektiv och känslig LC-MS-analys med identifieringsgränser (LOI) från 0,8 ng/mL för KP-54 till 10 pg/mL för TAK-448.
Analys av en referenspopulation bestående av 20 serumprover och 100 urinprover visade inga detekterbara signaler av endogena kisspeptiner eller deras nedbrytningsprodukter. Samtliga undersökta naturliga kisspeptiner uppvisade låg stabilitet i både urin och blod, men flera nedbrytningsprodukter kunde identifieras. Dessa metaboliter kan fungera som komplet-terande målsubstanser och därmed förbättra möjligheterna att upptäcka användning av kisspeptiner i dopingskontrollprover.
Sammantaget utgör studien en viktig grund för konfirmerande analys av kisspeptiner vid dopingskontroller och ger värdefulla in vitro-data om deras metabola beteende. För att ytterligare bedöma detekterbarheten och de metabola profilerna i autentiska prover krävs dock analyser av prover som samlats in efter administrering av peptiderna.
Referens: Krombholz S, Korsmeier L, Thomas A, Thevis M. Analysis and characterization of kisspeptin and its analogues in serum and urine samples by liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry for doping control purposes. Drug Test Anal 2026; 18: 862-876.