BLODDOPING

(Senast reviderad 2023-12-03)

BLODDOPING

(inkluderande erytropoietin)

Innehåll

Semantik

Inom idrott med människor avsåg termen “bloddopning” ursprungligen en process där idrottare ökade sin syretransportkapacitet genom att få blodtransfusioner från tidigare donerat blod för att öka sina hematokritvärden några dagar före tävlingen. Idag används “bloddopning” mer omfattande till att inkludera en rad olika metoder för att höja blodets syrebärande förmåga. Framsteg inom genetisk medicin har teoretiskt möjliggjort för idrottare att markant öka sin prestationsförmåga genom gendoping som påverkar olika processer av syntesen av olika delar erytopoesen även om användningen av erytropoietin och det som påverkar erytropoietins verkningar ingår i dag i det som benämns bloddoping.

Bloddopning i alla dess former är förbjudna av WADA.

Historia

Kort efter upptäckten av blodcirkulationen av den engelska läkaren William Harvey år 1628 försökte man genomföra den första empiriska blodtransfusionen. Den första dokumenterade mänskliga blodtransfusionen ägde rum år 1795. Det finns därför en lång historia av bloddopning, som traditionellt härstammar från anekdoter om alltifrån att idrottare uppmanades att exempelvis dricka renblod eller liknande för att uppnå extraordinära prestationer till verkliga transfusioner.

På 1930-talet stod det klart att mästare inom uthållighetsidrott hade anmärkningsvärt hög maximal syreupptagningsförmåga (VO2MAX). På 1950-talet, 1960-talet och 1970-talet utfördes klassiska studier om de fysiologiska faktorer som påverkar VO2MAX och dess nyckelroll inom uthållighetsprestationer. Under denna tid pågick en debatt om O2-leverans kontra O2-extraktion som “begränsande faktor” för VO2MAX. Iakttagelser under denna era fastställde tydligt maximalt hjärtminutvolym som en avgörande faktor för VO2MAX, och mycket höga värden för maximal hjärtminutvolym observerades hos mästare inom uthållighetsidrott.

Dessutom framkom den viktiga rollen som blodvolym och totalt hemoglobin i kroppen spelade som faktorer för syreupptagningsförmågan. I ett försök att bättre förstå de fysiologiska faktorerna bakom VO2MAX genomfördes studier som försökte manipulera O2-leverans med olika metoder, inklusive ändrade syrekoncentrationer, läkemedel som påskyndar eller fördröjer hjärtfrekvensen, och tekniker som ändrade totalt hemoglobin och hemoglobinkoncentration. Generellt sett stod det klart på 1970-talet att manövrar som ökade totalt hemoglobin ökade VO2MAX och manövrar som minskade totalt hemoglobin minskade VO2MAX. Dessa förändringar i VO2MAX verkade vara något oberoende av totalt blodvolym-innehåll, eftersom volymbelastning i sig hade liten inverkan på VO2MAX, och likaså ökade inte manövrar som orsakade hemokoncentration VO2MAX. Därför betonades vikten av totalt hemoglobin som en primär faktor för syreupptaget.

Parallellt med dessa mekanistiska studier om VO2MAX-faktorerna framkom tillämpade observationer om idrottsprestation och rollen av VO2MAX, mjölksyragräns och löpekonomi. Eftersom VO2MAX betraktades som en nyckelfaktor för prestation uppstod den nästa självklara frågan om manövrar som ökade totalt hemoglobin och VO2MAX även skulle öka prestationen. Ett antal studier som bekräftade den positiva påverkan av ökat totalt hemoglobin på prestation genomfördes. Dessutom cirkulerade olika rykten och insinuationer som antydde att åtminstone vissa uthållighetsidrottare använde denna teknik i ett försök att få en konkurrensfördel i internationella tävlingar. Därav myntades termen “bloddopning”. Även om det är klart att bloddopning förbättrar prestationen är det oklart hur vanligt det var på 1970-talet och 1980-talet eftersom upptäckt var svårt eftersom idrottare fick en återinfusion av sina egna röda blodkroppar.

De tidigaste rapporterna om bloddopning i vetenskaplig litteratur går tillbaka till 1945-1947. Det första påstådda användandet inom elitidrott skedde på 1960-talet, när en fransk cyklist som hade vunnit Tour de France fyra gånger (1961-1964) nämndes som en av de första cyklisterna att använda tekniken.

Under de olympiska spelen som hölls på måttlig höjd (2250 m över havet) i Mexico City 1968 ansågs höjdinducerade blodanpassningar, som en ökning av hemoglobinkoncentrationen, primärt vara ansvariga för att idrottare som bodde på hög höjd vann de flesta av uthållighets-loppen. Det första rapporterade användandet av blodtransfusioner inom friidrott kommer från tiden kring de olympiska spelen i Mexico City 1968.Detta fenomen initierade en ny forskningsinriktning på höjdträning inom idrottsfysiologi.

Blodtransfusioner och prestationer på hög höjd

Forskning kring blodtransfusioner som ett medel för förbättrad uthållighet påbörjades redan 1947 av Pace och hans kollegor. Transfusion av 500 ml allogeniska erytrocyter under fyra på varandra följande dagar minskade pulsfrekvensen under träning i simulerad hypoxi. Även om metoderna inte skulle uppfylla dagens standarder var detta den första av många studier som bekräftade den möjliga prestationshöjande effekten av blodtransfusioner. Av den anledningen förbjöds senare blodtransfusioner inom idrotten av Internationella Olympiska Kommittén (IOC) år 1986.

Även om det tidigaste beviset för förbättrade idrottsprestationer efter blodtransfusioner redan gavs år 1947, kom det första beviset på bloddopning senare, år 1972. Trots det fick blodtransfusioner som en metod för att förbättra uthållighetsprestationer uppmärksamhet redan efter Olympiska Spelen (OS) i Mexico City 1968. Innan dessa OS presenterades bevis för att ett sänkt atmosfäriskt tryck skulle minska prestationen inom alla idrottsdiscipliner som är beroende av en hög nivå av uthållig syreupptagning. Detta bekräftades i Mexico City, där alla vinnartider i löplopp över 800 m var betydligt sämre än världsrekorden vid den tiden. Detta betonade betydelsen av syreleverans till arbetande muskler som en begränsande faktor under helkroppsuthållig träning. Det blev också tydligt att löpare från högre altituder tenderade att vara överlägsna jämfört med konkurrenter från låglandet eftersom de hade “tjockt blod” med hög hemoglobinhalt.

Ett relativt enkelt sätt att öka hemoglobinkoncentrationen (Hb) och därmed syreleveransen till musklerna var genom blodtransfusioner. Detta dokumenterades i den klassiska studien av de svenska idrottsfysiologerna Björn Ekblom och hans kollegor, publicerad 1972, där en hög korrelation mellan hemoglobin och prestationsförmåga efter blodavtagning och återinfusion presenterades. Ett ökat hemoglobin med 13 procent åstadkommit av återinfusion av tre enheter lagrat autologt blod resulterade i en ökning av maximal syreupptagningsförmåga och fysisk prestation med 9 procent respektive 23 procent. Metoden att transfundera blod inom idrotten kallades härefter “bloddopning” av media, och dess kraftfulla effekt på idrotts-prestationer noterades snabbt inom idrottsgemenskapen

Militär användning av bloddoping

Redan 1947 studerade militärforskare sätt att öka stridspiloternas tolerans för hypoxi på hög höjd. I en sådan studie transfunderades röda blodkroppar till tio män vid US Naval Research facilitet, vilket resulterade i ökad syrekapacitet.

1993 började amerikanska specialstyrkor vid Fort Bragg experimentera med bloddopning, även känd som blodladdning. Specialstyrkans operatörer skulle tillhandahålla två enheter helblod, från vilka röda blodkroppar skulle extraheras, koncentreras och lagras under kalla temperaturer. 24 timmar före ett uppdrag eller strid skulle en liten mängd röda blodkroppar infunderas tillbaka i soldaten. Militärforskare ansåg att proceduren ökade soldaternas uthållighet och vakenhet på grund av ökningen av blodets förmåga att transportera syre.

1998 godkände de australiensiska försvarsstyrkorna denna teknik för Special Air Service Regiment. Senior nutritionist vid Australian Defense Science and Technology Organisation Chris Forbes-Ewan citeras för att ha sagt att “Vad vi försöker få är en fördel gentemot alla potentiella motståndare,”

Transfusionsdoping i praktiken

Det första påstådda användandet av blodbaserad prestationshöjning inom idrotten var på 1960-talet, när en fransk fyrfaldig vinnare av Tour de France (1961-1964) namngavs som en av de första cyklisterna att använda tekniken. Bloddopning användes säkerligen redan under OS 1972 av en finsk hinderlöpare, och under följande OS erkände flera idrottare att de hade använt bloddopning. Tekniken blev mer populär under 1980-talet och användes av lång-distanslöpare (5000 m, 10 000 m och maratonlöpare), cyklister och skidåkare. Särskilda anklagelser riktades mot ryssarna, italienarna, finländarna, amerikanerna och östtyskarna, speciellt under OS 1980 och 1984. Idrottare som erkände att de använde tekniken inklude-rade den italienska cyklisten som slog världsrekordet på en timme 1984 och en rysk långdistanslöpare som specifikt erkände autolog transfusion med två enheter utförd av lagläkare 1980.

Inte förrän efter OS i Los Angeles 1984, där det amerikanska cykelteamet använde bloddopning och vann 9 medaljer efter att inte ha vunnit någon medalj i cykling på 72 år, förbjöds metoden (både homologa och autologa transfusioner) av Internationella Olympiska Kommittén, även om ingen metod fanns tillgänglig för att upptäcka dess användning. Sedan dess finns det konsekventa rapporter om idrottare som experimenterar med blodtrans-fusioner och uppnår otrolig framgång i tävlingar.

Lasse Virén, en finsk långdistanslöpare som vann guldmedaljer på OS 1972 och 1976 på 5 000 m och 10 000 m, tros vara en av de första idrottarna som använde blodtransfusioner för att förbättra prestationen. Det bör noteras att denna teknik inte var förbjuden vid den tiden även om den etiska debatten pågick för fullt.. Det finns också viss evidens för att blodtransfusioner var en integrerad del av dopningsregimen som användes för att förbättra prestationen för idrottare från östblocket (Sovjetunionen, Östtyskland) vid den tiden. Trots det kan antas att på grund av logistiska krav för blodtappning och återinfusion var tekniken inte utbredd, eftersom de tekniska förutsättningarna endast var tillgängliga för ett litet antal idrottare och då nästan enbart för vissa elitidrottare

År senare, efter implementeringen av pålitliga strategier för att upptäcka dopning med rekom-binant erytropoietin och analoger, gjorde blodtransfusioner en kraftig comeback. I mars 2002 under de olympiska vinterspelen i Salt Lake City undersökte IOC upptäckten av kasserad utrustning för blodtransfusion i kvarteret för de österrikiska längdskidåkarna. Efter DNA-testning diskvalificerades två längdskidåkare och deras resultat annullerades. Av samma anledning fälldes några professionella cyklister, varav en nästan dog efter att ha blivit injicerad med dåligt förvarat blod, och de avstängdes 2004.

Även om testning för homologa blodtransfusioner hade utförts vid Lillehammer-OS 1994 med användning av antigentester, var det inte förrän 2004 vid OS i Aten som ett test hade validerats och implementerats. Vid detta tillfälle testades först vinnaren av herrarnas tempolopp i cykling positivt, men eftersom den reservprov (B-provet) var fruset och därmed förstördes de röda blodkropparna (RBC), kunde inget dopningsbrott bevisas. Efter att ha lämnat ytterligare positiva dopningstester vid Vuelta a España 2004 avstängdes cyklisten i 2 år.

Avstängningen av flera professionella landsvägscyklister från Tour de France 2006 kan representera toppen av ett isberg, med över 200 idrottare inom olika idrottsdiscipliner inblandade i en internationell dopingutredning inklusive blodtransfusioner och administrering av exogena hormoner. I en lägenhet i Madrid, som ägdes av en läkare, upptäckte spansk polis hemlig utrustning för internationellt bruk och beslagtog mer än 200 blodpåsar om 450 mL, tillsammans med register och flera andra dopningsämnen, vilket gjorde det möjligt för utredare att slutligen matcha kodnamn på idrottare med deras mycket detaljerade dopningsregister. Denna sofistikerade pan-europeiska dopningsring behandlade antingen idrottare lokalt eller arrangerade transporten av lagrat blod genom ett system av kurirer till idrottare på tävlingsplatser.

År 2004 införde Internationella Cykelfederationen, UCI, ett blodtest för att upptäcka homologa blodtransfusioner för att förbättra analysen av indirekta hematologiska parametrar som indikerar manipulering av blodet. Iakttagelser från UCI och FIFA indikerade tydligt att riskerna för missbruk av bloddoping skiljer sig åt i individuella uthållighetssporter jämfört med olympiska lagidrotter, till exempel. Följaktligen måste lämplig riskhantering baseras på data från negativa eller atypiska analytiska fynd samt efter att ha övervägt den uppskattade risken för dopning inom olika sporter.

Autologa blodtransfusioner (ABT)

Det uppenbara alternativet till homologa blodtransfusioner är autologa blodtransfusioner (ABT). År 2006, strax före Tour de France, avslöjades en omfattande spansk dopningsskandal, känd som Operación Puerto. En dopningring som involverande flera läkare avslöjades av den spanska polisen, och mer än 200 autologa blodenheter tillhörande professionella idrottare hittades i frysar och kylskåp för efterföljande återinfusion. Detaljerade dopningskalendrar från enskilda idrottare publicerades, och arbetssättet för involverade idrottare och deras läkare avslöjades.

Från dessa kalendrar blev det tydligt att förutom massiva missbruk av olika typer av prestationshöjande läkemedel och maskeringsmedel användes ABT under viktiga tävlingar. Proceduren med blodtappning och återinfusion utfördes många gånger för varje individuell idrottare under året med hjälp av specialutrustning för åderlåtning och förvaring. Vanligtvis drogs blodet efter tävlingar och återinfunderades några dagar före tävlingar. Sedan dess har idrottare som testats positivt för andra ämnen också bekräftat det pågående missbruket av ABT.

En övre gräns för tillåtet blodvärde

Ett sätt att försöka komma till rätta med bloddoping – som länge varit svår att bevisa på ett juridiskt hållbart sätt – var att istället fr att bevisa doping sätta en övre gräns för hur höga blodvärden som kunde tillåtas. Man motiverade gränserna med att det kunde vara farligt att tävla med alltför höga blodvärden, men naturligtvis var det i första hand ett tämligen enkelt sätt att sätta stopp för åtminstone den grövsta bloddopingen,

Gränsen för tillåtna hemoglobinkoncentrationer var är 2001 175 g/liter blod för herrar och 160 för damer. På lågland är den som inte är dopade inte i närheten av de värdena. När man tävlar på hög höjd kan däremot hemokoncentrationseffekten spela ett spratt för vissa åkare som ligger naturlig högt. Där skulle man kunna överväga en något högre Hb-gräns. Ett exempel var landslagsåkaren Niklas Jonsson som på lågland låg mellan 155 och 165, men som på hög höjd ibland hamnar nära den ovan angivna gränsen. Andra svenska åkare, Per Elofsson och Mattias Fredriksson, hade i Lahtis 149 i hemogloginhalt.

Vid OS i Aten 2004 användes flödescytometri för första gången för att påvisa blodtransfu-sioner. Någon idrottare blev aldrig fälld för bloddoping under spelen, vilket möjligen kan beror på kvarvarande metodsvagheter eftersom en OS-deltagare visades vara bloddopad vid nya prov två veckor senare [Catlin DH, Fitch KD, Ljungqvist A. Medicine and science in the fight against doping in sport. J Intern Med 2008; 264: 99-114].

Uppmärksammade fall av bloddopning

Bloddopning inom idrotten tog fart i slutet av 1960-talet och användes då oftast av medel- och långdistanslöpare. Det första kända fallet av bloddopning inträffade vid olympiska sommarspelen 1980 i Moskva då den finska löparen Kaarlo Maaninka transfunderades med en liter blod innan han vann medaljer på 5 och 10 000 meter (bloddoping var vid denna tidpunkt var inte reglernad).

Vid OS från München 1972 till London 2012 straffades 57 idrottare för bloddoping, vilket innebar att 12 idrottare förlorade 17 olympiska medaljer inklusive 12 guldmedaljer på grund av bloddopning. Fram till 1986 var infusion av blod inte förbjuden inom idrotten utan ansågs vara oetiskt. Erytropoietin förbjöds av Internationella olympiska kommitténs medicinska kommission 1990 [Referens: Fitch KD. Blood doping at the Olympic Games. J Sports Med Phys Fitness2017; 57: 1526-32].

Cyklisten Joop Zoetemelk erkände att ha tagit emot blodtransfusioner under Tour de France 1976, där han slutade tvåa, även om han hävdade att dessa var avsedda att behandla hans anemi snarare än att förbättra hans prestation. Samma år använde cyklisten Francesco Moser blodtransfusioner för att förbereda sitt framgångsrika försök att sätta rekord för hur långt man kan cykla på 60 minuter det vill säga att slå timrekordet.

Den svenske cyklisten Niklas Axelsson testade positivt för erytropoietin år 2000.

Den amerikanske cyklisten Tyler Hamilton påvisades bloddopad med ett fluorescensaktiverat cellsorteringstest som upptäckte homologa blodtransfusioner under OS 2004. Han fick behålla sin guldmedalj eftersom bearbetningen av hans prov förhindrade att genomföra ett andra, bekräftande test. Han överklagade ett andra positivt test för homolog transfusion från 2004 Vuelta a España till Internationella skiljedomstolen för idrott (CAS) men hans överklagande avslogs. Hamiltons advokater föreslog att Hamilton kunde vara en genetisk chimär för att förklara förekomsten av röda blodkroppar från mer än en person. Även om det är teoretiskt möjligt, ansågs dessa förklaringar vara av “försumbar sannolikhet”. Den 20 maj 2011 lämnade Tyler Hamilton in sin olympiska guldmedalj 2004 till den amerikanska antidopningsbyrån efter att ha erkänt dopning i en ”60 minuter”s intervju.

Tour de France-cyklisten Alexander Vinokourov, från Astana Team, testade positivt för två olika blodcellspopulationer och därmed för homolog transfusion efter sin seger i den 13:e etappen den 21 juli 2007. Ett dopingtest ansågs dock inte vara positivt förrän ett andra prov testas för att bekräfta det första. Vinokourovs B-prov testade också positivt, och han riskerade en eventuell avstängning på två år och böter motsvarande en årslön. Han testade också positivt efter steg 15. Om bestraffningen verkligen genomfördes är fortfarande oklart.

Vinokourovs lagkamrat Andrej Kashechkin testade också positivt för homolog bloddopning den 1 augusti 2007, bara några dagar efter avslutandet av Tour de France 2007 (ett lopp som hade dominerats av dopningsskandaler). Hans lag drog sig ur touren efter avslöjandet att Vinokourov varit dopad.

Enligt ryska utredare var den 19-årige New York Rangers-prospekten och ryske hockeyspelaren Alexei Cherepanov engagerad i bloddopning i flera månader innan han dog den 13 oktober 2008, efter att ha kollapsat på bänken under en match i Ryssland. Han hade också myokardit.

Den tyska skridskoåkaren och femfaldiga OS-guldmedaljören Claudia Pechstein stängdes av i två år 2009 för påstådd bloddopning, baserat på oregelbundna nivåer av retikulocyter i hennes blod och antagandet att dessa nivåer alltid var högst under tävlingar. Hennes genomsnittliga retikulocytantal under de tio åren från 2000 till 2009 var 2,1 procent under toppevenemang som olympiska spel och under världsmästerskap. Vid världscuptävlingar var medelretikulocyttalet 1,9 procent och under träningsfaserna 2,0 procent. Idrottens skiljedomstol CAS bekräftade förbudet i november 2009 genom att säga: “…när möjligheten av en blodsjukdom säkert har uteslutits…” I september 2010 avslog den schweiziska federala högsta domstolen idrottarens överklagande och angav att Pechsteins ärvda blodavvikelse hade varit känd tidigare (“die vererbte Blutanomalie bekannt gewesen sei”).

Den 23 augusti 2012 fråntogs Lance Armstrong sina sju Tour de France-titlar och avstängdes på livstid av cykelsportens styrande organ efter en rapport från den amerikanska antidopningsbyrån som anklagade honom för att ha lett ett dopingprogram under sin cykelkarriär. Han erkände senare att han använde förbjudna substanser inklusive bloddopning med transfusioner och erytropoietin i en intervju med Oprah Winfrey den 17 januari 2013.

I juni 2014 testade UFC-fightern Chael Sonnen positivt för erytropoietin. En månad senare testade en annan UFC-fighter, Ali Bagautinov, också positivt för erytropoietin.

I februari 2018 testades den kenyanskfödda 3000 meter häck-löparen Ruth Jebet, tävlande för Bahrein, positivt för EPO och den 4 mars stängdes hon av i 4 år.

Bloddopingens principer

Bloddopning är den form av dopning inom idrotten där antalet syretransportörer i blod-omloppet ökas för att förbättra idrottsprestationen – vanligtvis rör det sig om att öka antalet röda blodkroppar i cirkulationen, men det finns även andra alternativ. Eftersom röda blodkroppar transporterar syre från lungorna till musklerna kan en högre koncentration i blodet förbättra en idrottares aeroba kapacitet (VO2max) och därmed uthållighet. Bloddopning kan uppnås genom att få kroppen att producera fler röda blodkroppar själv med hjälp av mediciner, ge blodtransfusioner antingen från en annan person eller tillbaka till samma individ, eller genom att använda blodersättningsmedel.

Man kan emellertid uppnå ungefär samma effekt genom att öka hjärtats maximala slagvolym och maximala hjärtfrekvens – det vill säga att man ökar maximala cardiac output – vilket är vad som strävas efter vid konditionsträning. Man kan också tänka sig att försöka öka den maximala syrgasextraktionen ur blodet, vilket åtminstone teoretiskt kan göras genom att ändra syrets affinitet till blodkropparna och genom att påverka mitokondrierna respiratoriska kapacitet. Dessa två modeller kan dessutom samverka med ökat antal röda blodkroppar.

Hastigheten för maximalt O2-upptag (O2max) beror på således hjärtminutvolymen, O2- extraktion och hemoglobinmassan. En idrottares hjärtminutvolym är svår att manipulera under tävlingar och man har rätt att utgå från att av hjärtminutvolymen är maximal (cirka 80 %) under tävling. Dessutom är O2-extraktionen cirka 90 procent vid maximal träning. Därför är den mest praktiskt användbara metoden – för närvarande – för att förbättra den fysiska prestandan som finns kvar att öka O2-innehållet i artären genom att öka hemoglobinmassan förutom att blodvolym i sig också bidrar till prestationsförmågan

Många former av bloddopning härrör idag från missbruk av läkemedel. Dessa läkemedelsbe-handlingar har skapats för klinisk användning för att öka syretillförseln när människokroppen inte kan göra det naturligt – det vill säga för att behandla sjukdomar.

Blodtransfusioner

Blodtransfusioner kan traditionellt klassificeras som autologa, där blodgivaren och transfusionsmottagaren är en och samma person, eller som allogena/homologa, där blodet överförs till någon annan än givaren.

Den klassiska bloddopingen börjar vanligen med att 1 till 4 enheter blod (1 enhet = 450 mL blod) tappas ut flera veckor före tävlingen. Blodet centrifugeras, plasmakomponenterna återinfunderas omedelbart och blodkropparna, främst röda blodkroppar (RBC), förvaras kylda vid 4°C eller frysta vid -80°C. Eftersom blod som lagras genom kylning stadig förlorar röda blodkroppar, med tiden en betydande andel, ofta upp till 40 procent inom sjukvården, beroende på de lagrade röda blodkropparna inte är helt livskraftiga.  Frysningsprocessen begränsar däremot åldrandet av cellerna, vilket tillåter lagring av blodet i upp till 10 år med en förlust på bara 10 till 15 procent av RBC.

Lagrade röda blodkroppar återinfunderas sedan, vanligtvis 1 till 7 dagar före den tävling som kräver hög uthållighet. Eftersom en betydande mängd järn avlägsnas vid varje autolog transfusion, krävs oftast en tillräcklig tid för återhämtning på minst 3 dagar från den senaste donationen, och järntillskott ges till patienter som genomgår autologa donationer. Nästan 50 procent av autologa donationer används inte av givaren och kasseras, eftersom nuvarande standarder inte tillåter transfusion av dessa enheter till en annan patient av säkerhetsskäl.

Farmakologiska metoder

Erytropoietin

Erytropoietin (EPO) är ett glykoproteinhormon som produceras av de interstitiella fibro-blasterna i njuren för att signalerar för erytropoes i benmärgen. Vid fysiologiskt låg PaO2 – runt 40 mmHg – frigörs erytropoietin från njurarna för att öka hemoglobintransporten. Den ökade aktiviteten hos en hemocytoblast (RBC-stamcell) gör att blodet får en större kapacitet för syre. Kommersiellt erytropoietin utvecklades först för att motverka effekterna av cancer och njurskdom som orsak till blodbrist. Erytropoitin har emellertid sedemera blivit en missbrukssubstans främst för professionella cyklister och långdistanslöpare.

Det finns en lång rad av analoger till erytropoietin; alla med samma effekt men med olika verkningstid och administrationssätt. På senare år har man också utvecklat substanser som påverkar bildningen av erytropoietin och också dessa har förbjudits av WADA eftersom de kan missbrukas för dopingändamål.

Hypoxi-inducerbar faktor (HIF) stabilisator

Hypoxiinducerbar faktorstabilisator (HIF-stabilisator) är ett läkemedel som är framtaget i första hand för att behandla kronisk njursjukdom. Liksom de flesta transkriptionsfaktorer är HIF-transkriptionsfaktorn ansvarig för uttrycket av ett protein. HIF-stabilisatorn aktiverar aktiviteten av erytropoietin på grund av anemiinducerad hypoxi, metabolisk stress och vaskulogenes (skapandet av nya blodkärl). HIF-stabilisatorer har använts av cyklister i kombination med koboltklorid/desferrioxamin vilket stimulerar den naturliga produktionen av erytropoietinhormon. Kombinationen av läkemedel som frisätter erytropoietin på grund av ökad transkription på cellnivå ger en ökad effekt. Effekten avtar när HIF-stabilisatorerna, koboltklorid/desferrioxamin utsöndras och/eller sönderfaller av kroppen.

Myo-inositol trispyrofosfat (ITPP)

Myo-inositol trispyrofosfat (ITPP), även känd som förening nummer OXY111A, är en allosterisk effektor av hemoglobin som orsakar en förskjutning åt höger i syre-hemoglobin dissociationskurvan, vilket ökar mängden syre som frigörs från röda blodkroppar till omgivande vävnad under varje passag. genom det kardiovaskulära systemet. ITPP har varit föremål för antidopningsforskning på både människor och kapplöpningshästar.

Blodersättningsmedel

Biokemisk och bioteknologisk utveckling har möjliggjort nya tillvägagångssätt för att ersätta blodets syrebärande förmåga genom artificiella O2-bärare, allmänt kända som “blodersätt-ningsmedel”. De blodersättningar som för närvarande finns tillgängliga är främst polymeriserade hemoglobinlösningar eller hemoglobinbaserade syrebärare (HBOC) och perfluorkolväten (PFC). En särskild plats har dessa i det militära och i katastrofsituationer då det snabbt kan behövas mycket blod på otillgängliga platser och transport av blod är besvärligt.

Hemoglobinbaserade syrebärare (HBOC)

Hemoglobinbaserade syrebärare är intra-/intermolekylärt framställda humana eller animala hemoglobiner, endast optimerade för syretillförsel och längre intravaskulär cirkulation. Närvaron av 2,3-difosfoglycerat i erytrocyter upprätthåller hemoglobins normala affinitet för syre. HBOC innehåller inte erytrocyter och förlorar denna interaktion, sålunda har omodifierade humana HBOC-lösningar en mycket hög syreaffinitet vilket äventyrar deras funktion. Kemiska metoder som utvecklats för att övervinna detta problem har resulterat i bärare som effektivt frisätter syre vid den fysiologiska pO2 i perifera vävnader.

Ett gemensamt drag för alla HBOC är deras motstånd mot dissociering när de löses i media, vilket kontrasterar mot hemoglobints naturlig dissociation under icke-fysiologiska förhållanden. HBOC kan hypotetiskt ge större fördelar för idrottare än de som tillhandahålls av motsvarande hemoglobin vid traditionell infusion av röda blodkroppar. Den senaste utvecklingen har visat att HBOC inte bara är enkla RBC-ersättningar, utan mycket effektiva O2-donatorer när det gäller vävnadssyresättning. Ytterligare effekter inkluderar ökningar av blodserumjärn, ferritin och erytropoietin; upp till 20 procent ökad diffusion av syre och förbättrad träningskapacitet; ökad CO2-produktion; och lägre mjölksyragenerering vid anaerob aktivitet. HBOC har emellertid i försök visat sig vara farligt för människor i vissa situationer. Eftersom HBOC ökar både risken för dödsfall och risken för hjärtinfarkt avslutades kliniska prövningar på denna indikation. De är inte kommersiellt tillgängliga i USA eller Europa och det finns för närvarande ingen godkänd användning för dem, men trots det tycks de har använts i dopingsammanhang.

Perfluorkolväten (PFC)

PFC, även känd som fluorkolväten, är inerta, vattenolösliga, syntetiska föreningar, som huvudsakligen består av kol- och fluoratomer bundna tillsammans i starka C–F-bindningar. PFC är väsentligen klara och färglösa flytande emulsioner som är heterogena i molekylvikt, ytarea, elektronisk laddning och viskositet; deras höga halt av elektrontäta fluoratomer resulterar i liten intramolekylär interaktion och låg ytspänning, vilket gör sådana ämnen till utmärkta lösningsmedel för gaser, särskilt syre och koldioxid. Vissa av dessa molekyler kan lösa upp 100 gånger mer syre än plasma. PFC är naturligt hydrofoba och måste emulgeras för att kunna injiceras intravenöst. Eftersom PFC löser snarare än binder syre, bestäms deras förmåga att fungera som blodersättning huvudsakligen av pO2-gradienterna i lungan och i målvävnaden. Därför skiljer sig deras syretransportegenskaper avsevärt från de för helblod och speciellt från de hos röda blodkroppar. Vid en konventionell omgivande pO2 på 135 mmHg är syrehalten på 900 mL/L perfluorkolväte mindre än 50 mL/L, medan en optimal syrehalt på 160 mL/L, vilket fortfarande är lägre än i helblod under normala förhållanden, som endast kan uppnås genom en pO2 mer än 500 mmHg. I praktiken, vid en konventionell alveolär pO2 på 135 mmHg, kommer PFC inte att kunna ge tillräcklig syresättning till perifera vävnader.

På grund av sin ringa storlek kan PFC tränga igenom cirkulationen där erytrocyter kanske inte kan ta sig in. I små kapillärer ger PFC den största fördelen, eftersom de ökar den lokala syretillförseln mycket mer effektivt än vad som skulle förväntas från ökningen av syrehalten i större artärer. Dessutom, eftersom gaser är i löst tillstånd i PFC, främjar det pO2 effektiv syretillförsel till perifera vävnader. Sedan mitten av 1980-talet har förbättringar av både syrekapacitet och emulsionsegenskaper hos PFC lett till utvecklingen av andra generationens PFC-baserade syrebärare; två PFC-produkter testas för närvarande (2023) i kliniska fas III-prövningar.

Koboltklorid

Övergångsmetallkomplex är allmänt kända för att spela viktiga roller vid blodnybildning och som sådan har oorganiskt tillskott visat sig vara en framväxande teknik inom blod-dopning. Särskilt anmärkningsvärt är koboltkomplexet, kobalamin (Vitamin B12) som vanligtvis används som kosttillskott. Kobalamin är ett viktigt komplex som används vid tillverkning av röda blodkroppar och var därför av intresse för potentiell användning vid bloddoping.

Experimentella bevis har dock visat att kobalamin inte har någon effekt på erytropoes vid frånvaro av röda blodkroppar/syrebrist. Dessa resultat verkar bekräfta mycket av det som redan är känt om hur kobalamin fungerar. Signalvägen som inducerar utsöndring av erytropoietin och därefter tillverkning av röda blodkroppar med användning av kobalamin är O2-beroende. Erytropoietin utsöndras endast i njurarna när det finns en O2 -brist, som sådan är RBC-framställningen oberoende av mängden kobalamin som administreras när det inte finns någon O2-brist. Följaktligen är kobalamin av ringa eller inget värde vid bloddopning.

Mer potent för användning vid bloddopning är Co2+ (tillfört som kobolt(II)klorid, CoCl2).

Koboltklorid har varit känt för att vara användbart vid behandling av anemiska patienter. Nya experimentella bevis har bevisat viss effektiviteten av koboltklorid också vid bloddopning. Studier av verkan av denna art har visat att Co2+ inducerar hypoxiliknande reaktioner, där det mest relevanta fysiologiska svaret är erytropoes. Co2+ inducerar detta svar genom att binda till N-terminalen (loop helix loop-domän) av de hypoxia-inducerande transkriptionsfaktorerna HIF-1alfa och HIF-2alfa, och stabiliserar sålunda dessa proteinkomplex. Under normala O2-förhållanden destabiliseras HIF som prolin och asparaginrester och hydroxyleras av HIF-alfa hydroxylaser. Dessa instabila HIF bryts sedan ned enligt en ubiquitin-proteosom-väg, och som sådan kan de inte binda och aktivera transkription av gener som kodar för erytropoietin. Co 2+-stabilisering förhindras emellertid nedbrytningen och gener som kodar för erytropoietin kan således aktiveras. Mekanismen för denna stabilisering av Co2+ N-terminalen är dock ännu inte helt klarlagd. Förutom N-terminalbindning har det också antagits att ersättning av Fe2+ med Co2+ i det hydroxylasaktiva stället kan vara en bidragande faktor till den stabiliserande verkan av Co2+. Det är dock underförstått att Co2+-bindning tillåter ubiquitin-bindning men förhindrar proteosomal nedbrytning.

Potentiellt skadliga effekter av bloddoping

Den enkla handlingen att öka antalet röda blodkroppar i blodet kan associeras med hyperviskositetssyndrom som kännetecknas av ökad blodviskositet och minskad hjärtminutvolym och blodflödeshastighet vilket resulterar i minskning av perifer syretillförsel. Till exempel kan en överdos av erytropoietin göra blod till ett trögflytande och artärtäppande slam. Detta ökar risken för hjärtinfarkt, stroke, blodpropp och lungemboli , vilket har setts i fall där för mycket blod återinförs i blodomloppet. Eftersom bloddopning ökar volymen av röda blodkroppar, introducerar det effektivt ett tillstånd som kallas polycytemi, en blodsjukdom som har känt negativa resultat såsom hjärtinfarkt eller stroke.

Blodkontamination under beredning eller lagring är en annan fråga. Kontaminering sågs av 1 av 500 000 transfusioner av röda blodkroppar 2002. Blodkontamination kan leda till sepsis eller en infektion som påverkar hela kroppen.

Bloddopingens status 2023

Genom förbättrade direkta och indirekta detektionsmetoder har bloddopingen till stor del ändrat karaktär i riktning mot mikrodosering. Man kan dock konstatera att goda vetenskapliga studier till stor del saknas avseende hur effektiv metoden är.

Det finns emellertid tre randomiserade, placebokontrollerade studier som visar att 130 mL packade röda blodkroppar eller 9 IU rhEpo tre gånger i veckan under fyra veckor ökade uthålligheten med 4-6 procent. Mekanismen bakom detta tycks vara en ökad syrebärande kapacitet, vilken medförde en ökad syrgasextraktion i musklerna och sannolikt ett ökat blodflöde till de arbetande musklerna. Storlekordningen 4-6 procents ökning av uthålligheten är mycket i den yppersta eliten.

De storlekar på doping som här redovisas kan påvisa 20-60 procent av de som blodopar sig enligt blodpassen, något beroende på när blodproven tas.

De nya biomarkörer som är mest lovande är omogna retikulocyter och de järnreglerande hormonerna hepcidin och erytroferon [Referens: Breenfeldt Andersen A, Nordsborg NB, Bonne TC, Bejder J. Contemporary blood doping – performance, mechanism, and detection. Scand J Med Sci Sports 2022 Oct 13 [Epub ahead of print].

HOMOLOG TRANSFUSION

Påvisande av homologa blodtransfusioner

Bloddoping kan räknas in som ”beprövad erfarenhet” när det gäller att öka prestations-förmågan i uthållighetsidrotter. Trots idogt forskningsarbete har det varit svårt att finna någon idrottsjuridiskt hållbar metod att fastställa bloddoping genom transfusion av någon annan människas blod (kompatibelt med mottagarens blodgrupper).

Den här aktuella forskningsrapporten strävade efter att hitta en metod som kunde fastställa bloddoping med minskad risk för falskt negativa resultat genom att:

Monitorera ett större spektrum av de röda blodkropparnas ytantigener

Färga speciellt utvalda ytantigener på blodkropparna

Man påvisade att det fanns en betydande tidsfaktor – viktigt vid blod som förvaras i blodbanker – eftersom hemolys (nedbrytning av blodkropparna) påverkade resultatet av undersökningarna.

Man kunde också visa att det egentligen bara behövdes fyra tidigare inte använda antigen tillsammans med nya färgningsprotokoll för att signifikant öka möjligheterna att upptäcka bloddoping med blod från blodbanker [Referens: Donati F, de la Torre X, Pagliarosi S, Pirri D, Prevete G, Botrè F. Detection of homologous blood transfusion in sport doping by flow cytofluorimetry: state of the art and new approaches to reduce the risk of false-negative results. Front Sports Act Living 2022; 4: 808449].

AUTOLOG TRANSFUSION

Autolog bloddoping (ABD)

Med autolog blodtransfusion menas att man först tar blod från en person och sedan vid ett senare tillfälle ger tillbaka blodet till samma person – det vill säga som vid klassisk bloddoping. Denna typ av bloddoping är praktiskt krånglig och det föreligger stor risk för upptäckt genom att någon ser hur det utförs eller att attiraljerna för proceduren upptäcks. Samtidigt kan den vara lockande för den som vill dopa sig eftersom den ger påtagliga resultat i uthållighetsidrotter och eftersom den inte ännu går att upptäcka juridiskt hållbart med någon laboratoriemetod.

Man har haft förhoppningar om att cirkulerande microRNA skulle kunna påvisa om det skett också någon analog blodtransfusion. Man randomiserde därför 30 friska män (inte idrottsutövare särskilt) och bloddopade hälften med personernas eget blod.

Utvärderingen gjordes sedan med avseende på enstaka microRNA och sammansatta data (”fingeravtryck”) men visade sig inte vara bättre än blodpass, som ju både är väl utvärderat och visats fungera rent praktiskt [Referens: Mussack V, Wittmann G, Pfaffl MW. On the trail of blood doping-microRNA fingerprints to monitor autologous blood transfusions in vivo. Am J Hematol 2021; 96: 338-53]

Inom medicinsk verksamhet kan man tänka sig att planera för ADB exempelvis inför en större operation där det kan tänkas behövas en blodtransfusion. Vanligtvis brukar man beräkna att om man tappar ut cirka 500 mL blod så har det återbildats av kroppen inom fyra veckor med rimlig marginal.

Trots att det är förbjudet enligt WADA:s regler är det känt att ADB förekommer som ett sätt att öka syreupptagningsförmågan inom idrotten. Hittills har det inte funnits någon metod att via blodprov påvisa ABD med en sådan säkerhet att det varit juridiskt accepterat, varför man har använt blodpass i stället för att visa att manipulationer med blodet förekommit.

I en ny studie följde man nu olika parametrar på blodets egenskaper under hela bloddopings-förfarandet och med särskild inriktning på prestationsförmågan. Man följde åtta friska män under en 31-veckorsperiod under vilken man först tappade blod och sedan gav två blodtransfusion motsvarande 8 procent av försökspersonernas blodvolym var gång.

De viktigaste fynden avseende de röda blodkropparna var att man fann en högre procentandel unga röda blodkroppar hos de transfunderade än väntat – kanske hade man förväntat sig att det skulle vara fler (transfunderade) gamla blodkroppar – att de röda blodkropparnas utseende ändrades (altered RBC deformability) och att elektrolyt-koncentrationerna i blodet ändrades. Däremot ändrads inte de röda blodkropparnas membranproteiner.

Som förväntat förbättrades löpekonomin efter transfusionerna.

Studien var av basal karaktär men gav ett underlag för fortsatt forskning. Det finns dock fortfarande inte något enkelt sätt att kemiskt avslöja bloddoping [Referens: Grau M, Zollmann E, Bros J, Seeger B, Dietz T, Noriega Ureña JA, Grolle A, Zacher J, Notbohm HL, Suck G, Bloch W, Schumann M. Autologous blood doping induced changes in red blood cell rheologic parameters, rbc age distribution, and performance. Biology (Basel). 2022; 11: 647].

Effekten av en autolog blodtransfusion (ABT)

En av de första studierna om hur autologa blodtransfusioner (ABT) påverkar den fysiska prestationsförmågan slutfördes 1960 och visade att effekten vid en hjärtfrekvens på 170 slag per minut försämras med cirka 8 procent efter tappning av 600 mL blod och ökar med cirka 4 procent efter återinfusion av kylt helblod [Gullbring B, Holmgren A, Sjostrand T, Strandell T. The effect of blood volume variations on the pulse rate in supine and upright positions and during exercise. Acta Physiol Scand 1960; 50: 62–71]. Sedan dess har flera studier bekräftat att ABT förbättrar träningsprestanda under olika träningsformer och varaktigheter. Dock är ABT förknippat med hälsorisker (till exempel bakteriell kontaminering, hemolys och allergiska reaktioner) och strider mot idrottens anda. Därför är användningen av ABT förbjuden inom tävlingsidrott sedan 1986.

Denna granskning utvärderar kritiskt den omfattning av prestandaförbättring som kan förväntas från olika autologa blodtransfusions metoder och de underliggande fysiologiska mekanismerna. Granskningen är baserad på en systematisk sökning av tillgänglig litteratur. Av 28 studier kan 4 betraktas som av mycket hög kvalitet, det vill säga placebo-kontrollerade, dubbelblinda crossover-studier. Både högkvalitativa studier och andra studier har generellt sett rapporterat prestandaförbättrande effekter av ABT på träningsintensiteter som varierar från 70 till 100 procent av absolut maximalt syreupptag (VO2peak) med varaktighet på 5–45 minuter, och effekten observerades även hos vältränade idrottare. Det finns ett linjärt samband mellan ABT-volym och förändring i VO2peak. Det troliga sambandet mellan ABT-volym och uthållighetsprestanda var inte tydligt i de få tillgängliga studierna, men återinfusion av så lite som 135 mL packade röda blodkroppar har visats öka prestandan i tidstest.

Återinfusion av röda blodkroppar ökar uthållighetsprestanda genom att höja det arteriella syreinnehållet (CaO2). Det ökade CaO2 åtföljs av reducerade laktatkoncentrationer vid submaximal intensitet samt ökat VO2peak. Båda effekterna förbättrar uthållighetsprestanda. Tydligen förklarar förändringen i hemoglobinkoncentration ökningen i VO2peak i samband med ABT eftersom blodvolym och maximal hjärtminutvolym har förblivit konstanta i majoriteten av ABT-studierna. Således måste den arteriell-venösa O2-differensen under träning ökas efter återinfusion, vilket stöds av experimentella bevis. Dessutom är det möjligt att ABT kan förbättra upprepad sprintprestanda, men det saknas studier om detta ämne. Den enda tillgängliga studien visade inte en prestandaförbättrande effekt av återinfusion vid 4 × 30 s sprint. De granskade studierna är viktiga både för den fysiologiska förståelsen av hur ABT interagerar med träningsförmågan och med avseende på antidopningsinsatser. Återinfusion med så lite som 135 mL packade röda blodkroppar ökar dock prestationsförmågan i tidsförsök. Ur ett antidopningsperspektiv visar litteraturgranskningen behovet av metoder för att upptäcka även små ABT-volymer [Referens: Solheim SA, Bejder J, Breenfeldt Andersen A, Mørkeberg J, Nordsborg NB. Autologous blood transfusion enhances exercise performance-strength of the evidence and physiological mechanisms. Sports Med Open 2019; 5: 30].

Autolog dopning med frysta röda blodkroppar: effekter på fysisk prestation

Av den sammanfattade litteraturen kan man uppskatta att elitidrottare kan komma att förbättra prestationen med upp till 3 procent med bloddopning, oavsett metod. Denna förbättring motsvarar till exempel sju minuter snabbare segertid i 90 km längdskidåkning Vasaloppet, 20–30 sekunder snabbare tid på en given 5000 m löpning på världsklassnivå och fyra minuter snabbare sluttid i ett maratonlopplopp. Inom cykling leder en 3 procentig ökning i prestanda till en mer än två timmar snabbare vinsttid i Tour de France 2014.

En studie undersökte känsligheten för dopningsdetektering baserat på mätningar av hemoglobin, hematokrit, retikulocytprocent (%ret) serum EPO och löslig transferrin-receptor. Resultaten visade en signifikant ökning av %ret och minskning av koncentrationen av Hb som en konsekvens av donationen. Donationstiden är dock svår att förutsäga, eftersom kryokonservering gör det möjligt att lagra blod under lång tid (år till decen-nier). Hematologiska såväl som prestationshöjande effekter kan pågå i veckor till månader hos både män och kvinnor. Provtagning av blod från alla idrottare med avsikt att upptäcka en blodtransfusion är således föremål för slumpen, när både donation och återinfusion kan göras när som helst utanför tävling.

Upptäckten av erytropoietin (EPO) förenklade bloddopningen inom idrotten, men förbättrade upptäcktsmetoderna, eftersom erytropoietin har tvingat fuskidrottare att återgå till blodtransfusion. Autolog blodtransfusion med kryokonserverade röda blodkroppar (RBC) är den valda metoden, eftersom det inte finns någon juridiskt giltig metod för att exakt upptäcka transfusionen. I en studie av transfusioner deltog fritidsidrottare (n=27) och kvinnliga (n=11) idrottare tjänstgjorde som transfusions- (n=28) och kontroll- (n=10) försökspersoner vid två olika transfusionsstorlekar. Hematologiska variabler och fysisk prestation mättes före donation av 450 eller 900 mL helblod, och till fyra veckor efter återinfusion av den kryokonserverade RBC-fraktionen. Blod analyserades för transferrin, järn, Hb, EVF, MCV, MCHC, retikulocyter, leukocyter och erytropoietin. Upprepade mätningar multivariat variansanalys (MANOVA) och mönsterigenkänning med hjälp av Principal Component Analysis (PCA) och Ortogonal Projections of Latent Structures (OPLS) diskriminantanalys (DA) undersökte skillnader mellan kontroll- och transfusionsgrupper över tid.

Betydande ökning av prestationsförmåga (15 ± 8 %) och VO2max (17 ± 10 %) (medelvärde ± SD) kunde mätas 48 timmar efter RBC-återinfusion och förblev ökad i upp till fyra veckor hos vissa försökspersoner. Totalt ingick 533 blodprover i studien. Som svar på blodtransfusion inträffade den största förändringen i hematologiska variabler 48 timmar efter bloddonation, när kontroll- och transfusionsgrupper kunde separeras med OPLS-DA. RBC-återinfusion resulterade i den bästa modellen vid den första provtagningspunkten (48 timmar), vilket förutspådde en falsk positiv och en falsk negativ. Sammantaget uppnåddes ett förhållande på 25 procent och 86 procent falskt positiva i två separata försök. Sammanfattningsvis ökade autolog återinfusion av röda blodkroppar VO2max och prestanda enligt hypotesen, men hematologisk profilering med multivariat statistik kunde inte nå det WADA-föreskrivna falska positiva förhållandet på <0,001 procent vid någon undersökt tidpunkt. En majoritet av proverna höll sig hela tiden inom gränserna för normal individuell variation [Referens: Malm CB, Khoo NS, Granlund I, Lindstedt E, Hult A. Autologous doping with cryopreserved red blood cells - effects on physical performance and detection by multivariate statistics. PLoS One 2016; 11: e015615799].

ERYTROPOIETIN GENERELLT

Tidig dopinghistoria för erytropoietin

Ett artificiellt erythropoietin (recombinant human EPO, rhEPO) fans kommersiellt tillgängligt från och det stod sanbbt klart att detta var ett utmärkt dopingmedel – förhållandevis billigt, lättadminisrerat och svårt att upptäcka.

Initialt var det svårt att mäta rhEPO rent laboratoriemässigt och dessutom har molekylen en mycket kort halveringstid i blodet, medan effekten sitter i länge vilket gör att dopingtillfället sker när dopingtester inte förväntas och exempelvis aldrig strax innan tävling.

De första försöken att påvisa doping med erytropoietin gjordes genom indirekta tester, vilket innebar att man mätte hematokrit eller hemoglobin. Några förbund sa sig göra ”hälsotest” före start i större tävlingar och exempelvis Internationella Cykelförbundet satte gränserna 50 procent för män 47 procent för kvinnor för att få starta vid tävling [Catlin DH et al.|Review: Medicine and science in anti-doping. J Intern Med 2008; 264; 99-114]. En sådan bestämmelse undviker att peka ut någon för doping och kan således inte heller leda till någon bestraffning.

Ett direkt test – nämligen att man mäter rhEPO – är svårare än avseende flera andra peptidhormoner är att endogent erytropoietin består av en familj av isoformer, som skiljer sig åt genom olika former av glycosilering. Detta skiljer sig från rhEPO, vilka endast består av en isoform, och man kan därför skilja urinens endogena och exogena erytropoietin genom elektrofores.

Ett ytterligare steg framåt beskrevs år 2000 då man införde isoelektrisk fokusering (IEF) som utföres i två steg där man först tillsätter en antikropp och i ett andra steg en antikropp mot den första antikroppen, vilket indikerar att metoden kräver mycket arbete. Metoden användes första gången vid OS 2002 i Salt Lake City varvid man för första gången påvisade dopingfall med darbepopoietin, som är en långverkande rhEPO. Darbopoietin påvisades hos tre idrottare som tillsammans hade vunnit åtta medaljer [Referens: Catlin DH, Fitch KD, Ljungqvist A. Medicine and science in the fight against doping in sport. J Intern Med 2008; 264: 99-114].

LÅGDOSERYTROPOIETIN

Omogna retikulocyter vid doping med lågdoserythropoietin

De röda blodkropparna lever hos vuxna i cirka 120 dagar, hos barn har de något kortare livslängd. De lever till det att dess förråd av enzymer som upprätthåller membranets flexibilitet avtar. Retikulocyter är omogna röda blodkroppar (RBC). Vid bildning av röda blodkroppar utvecklas och mognar retikulocyter i benmärgen och cirkulerar sedan i cirka en dag i blodströmmen innan de utvecklas till mogna röda blodkroppar. Precis som mogna röda blodkroppar har retikulocyter hos däggdjur inte en cellkärna . De kallas retikulocyter på grund av ett retikulärt (meshliknande) nätverk av ribosomalt RNA. I princip kan man säga att retikulocyter skall vara 1/120-del av blodmassan, men om kroppen ser det som att det föreligger en blodbrist bildas fler – antalet reticulocyter kan således tas som ett mått på hastigheten i bildning av röda blodkroppar.

Tillförsel av erytropoietin (”EPO”) ökar antalet reticulocyter som pressas ut från benmärgen snabbare än vad som annars skulle vara fallet och ökar således antalet röda blodkroppar i cirkulationen. En del av dessa reticulocyter är då mer omogna än vad annars skulle vara fallet och kan mätas särskilt.

I en dansk studie mätte man nu fraktionen omogna reticulocyter (IRF) och kvoten mellan omogna reticulocyter och röda blodkroppar (IR/RBC) efter att man injicerat låga doser erytropoietin – så låga doser att det inte förväntats ge utslag vid dopingtester – varannan dag i tre veckor. Som kontroll sprutade an placebo. Experimenten gjordes dels i Köpenhamn, dels på 2230 meters höjd.

Man kunde visa att på hög höjd var IRF och IR/RBC signifikant förhöjda (40 % respektive 110 %) efter EPO-behandling, vid havsnivåhöjd var motsvarande siffror 70 och 190 procent. Sensitiviteten för doping var 90 procent och specificiteten var >99 procent.

Det är för tidigt att använda dessa data i rutinmässig dopingtestning, men det är intressant att även lågdos-EPO kan påvisas – åtminstone experimentellt [Refererens: Jeppesen JS, Breenfeldt Andersen A, Bonne TC, Thomassen M, Sørensen H, Nordsborg NB, Olsen NV, Huertas JR, Bejder J. Immature reticulocytes are sensitive and specific to low-dose erythropoietin treatment at sea level and altitude. Drug Test Anal 2021; 13: 1331-40].

Känsliga parametrar för att avslöja mikrodosering av erytropoietin

Man undersökte om den omogna retikulocytfraktionen (IRF) och förhållandet mellan omogna retikulocyter och röda blodkroppar (IR/RBC) är känsliga och specifika biomarkörer för mikrodos rekombinant human erytropoetin (rHuEPO), och om inkluderingen av retikulocyt-percentaget (RET%) och algoritmen “abnormal blood profile score (ABPS)” ökade känsligheten för idrottsutövarens biologiska pass (ABP) jämfört med hemoglobin koncentrationen ([Hb]) och OFF-hr score ([Hb]-60 × rotenRET%).

Fyrtioåtta deltagare (24 kvinnor, 24 män) genomförde en 2-veckors baselineperiod följt av en 4-veckors interventionsperiod med tre veckovisa intravenösa injektioner av 9 IU/kg kroppsvikt epoetin beta (12 kvinnor, 12 män) eller saltlösning (0,9 % NaCl, 12 kvinnor, 12 män) och en 10-dagars uppföljning. Blodprover samlades veckovis under baseline och intervention samt 3, 5 och 10 dagar efter behandling.

rHuEPO-behandlingen ökade [Hb], RET%, IRF och IR/RBC signifikant. IRF och IR/RBC ökade till 58 respektive 141 procent högre jämfört med placebo, och beräknade tröskel-värden gav en toppkänslighet över tidpunkter på 58 respektive 54 procent med 98 procent specificitet. För att uppnå >99 procents specificitet för IRF och IR/RBC minskades känsligheten till 46 respektive 50 procent. Över alla tidpunkter ökade tillägget av RET% och ABPS till ABP känsligheten från 29 till 46 procent. Identifiering av verkliga positiva avvikelser som erhölls via ABP och IRF och IR/RBC ökade känsligheten över alla tidpunkter till 79 procent.

Sammanfattningsvis är IRF, IR/RBC, RET% och ABPS känsliga och specifika biomarkörer för mikrodos rHuEPO både hos män och kvinnor och kompletterar ABP [Referens: Breenfeldt Andersen A, Bejder J, Bonne TC, Graae J, Seier S, Nordsborg NB. Changes in immature reticulocytes aid the indirect detection of microdose recombinant erythropoietin use in men and women. Med Sci Sports Exerc 2023; 55: 1695-705].

Förändringar i omogna retikulocyter vid mikrodosanvändning av rHuEPO

Man undersökte om omogna retikulocytfraktioner (IRF) och förhållandet mellan omogna retikulocyter och röda blodkroppar (IR/RBC) är känsliga som specifika biomarkörer för mikrodos rekombinant humant erytropoietin (rHuEPO) och om inkluderingen av retikulocytprocent (RET% ) och algoritmen “abnormal blood profile score (ABPS)” ökade idrottarens biologiska pass (ABP) känslighet jämfört med hemoglobinkoncentrationen ([Hb]) och OFF-scorepoängen.

Fyrtioåtta individer (lika antal män och kvinnor) avslutade en tvåveckors baslinjeperiod följt av en fyra veckors interventionsperiod med tre intravenösa injektioner i veckan av 9 IE/kg kroppsvikt epoetin-beta eller koksaltlösning (0,9 % NaCl) och en 10-dagars uppföljning. Blodprover togs varje vecka under baslinjen och interventionen samt 3, 5 och 10 dagar efter behandling.

rHuEPO-behandlingen ökade signifikant koncentrationen av hemoglobin (tid×behandling), RET% (tid×behandling), IRF (tid×behandling) och IR/RBC (tid×behandling). IRF och IR/RBC var upp till 58 respektive 141 procent högre jämfört med placebo, och beräknade tröskel-värden gav en toppkänslighet över tidpunkter på 58 och 54 procent med 98 procent specificitet, respektive. För att uppnå >99 procent specificitet för IRF och IR/RBC reducerades sensitiviteten till 46 respektive 50 procent. Över alla tidpunkter ökade tillägget av RET% och ABPS till ABP känsligheten från 29 till 46 procent. Identifiering av sant positiva extremvärden erhållna via ABP och IRF och IR/RBC ökade känsligheten över alla tidpunkter till 79 procent.

Sammanfattningsvis är IRF, IR/RBC, RET% och ABPS känsliga och specifika biomarkörer för mikrodos rHuEPO hos både män och kvinnor och kompletterar ABP [Referens: Breenfeldt Andersen A, Bejder J, Bonne TC, Graae J, Seier S, Nordsborg NB. Changes in immature reticulocytes aid the indirect detection of micro-dose recombinant erythropoietin use in males and females. Med Sci Sports Exerc 2023 Apr 25 [Online ahead of print].

mRNA-testning för att upptäcka mikrodoser av erytropoietin

Doping med erythropoietin och dess analoger ger fördelar i uthållighetsidrotter, med dopingförsöken kan numera väl avslöjas med känsliga tester av erytropoietin i urinprov taget någon eller ett fåtal dagar efter dopingförsöket eller med blodpass om det gäller längre fram. Doparnas ”motdrag” mot detta att ge så små doser att det inte sysn i urinproven och så ofta att det blir det normala i blodpassen.

Man visade nu att mRNA för 5’-aminolevulinate synthase 2 (ALAS2) är en indirekt metod för att påvisa mikrodosering av erytropoietin. Känsligheten var också så stor att man kunde skilja det tillförda erytropoietinet från det som kroppen tillverkar exempelvis vid långvarig syrebrist (höghöjdsliv).

Man mätte mRNA för två enzymer under 16 dagars tillförsel av erytropoietin i mikrodosering ALAS2 mRNAs ökade med 300 procent av erytropoieteinet, men ökade inte signifikant av hypoxi.

mRNA för carbonate anhydrase 1 (CA1) ökade däremot efter åade tillförsel av erythropoietin och efter hypoxi, medan mRNA för solute carrier family 4 member 1 (SLC4A1) inte ökade alls.

Man använde blodprov sparade på DBS (dried blood spot), vilket ger logistska fördelar.

Sammanfattningsvis kan man med denna typ av mRNA-tstning med rimligt stor säkerhet påvisa dopingförsök med mikrodoseraterytropoietin [Referens: Loria F, Cox HD, Voss SC, Rocca A, Miller GD, Townsend N, Georgakopoulos C, Eichner D, Kuuranne T, Leuenberger N. The use of RNA-based 5’-aminolevulinate synthase 2 biomarkers in dried blood spots to detect recombinant human erythropoietin microdoses. Drug Test Anal. 2022; 14: 826-32].

GENDOPING MED ERYTROPOIETIN

En ny metod för påvisande av gendoping (erytropoietin)

Gendopning har klassificerats som en förbjuden metod av World Anti-Doping Agency (WADA) och International Olympic Committee (IOC) i över två decennier. Genetiska terapeutiska in vivo-metoder är baserade på överföring av nukleinsyror eller nukleinsyraanaloger till människokroppen, till exempel via intravenösa eller direkta vävnadsinjektioner (exempelvis intramuskulära). Överföringen av transgena DNA-sekvenser kan uppnås med olika strategier, inklusive användning av rekombinanta virala vektorsystem (som adenovirala eller adeno-associerade virala (AAV) system) eller icke-virala vektorer (som bakteriella plasmider eller minicirkulära DNA) som antingen kan överföras “nakna” (ofta assisterade av fysisk kraft) eller komplexerade med till exempel kationiska lipider eller polymerer. När produktion, överföring och expressionsmetoder förfinas och förbättras, kan en ökad överföring av genetiska terapimetoder till klinisk standardvård och deras kommersiali-sering på läkemedelsmarknaden förutses, vilket gör gendopningstillbud alltmer sannolika.

År 2021 godkände WADA det första protokollet för genetisk dopningstestning för detektion av exon–exon-anslutningar av intronlösa komplementärt DNA (cDNA)-sekvenser från den mänskliga erytropoietingenen (EPO) i helblod genom användning av kvantitativ realtids-PCR (qPCR). Andra metodologiska tillvägagångssätt via (nested) end-point polymeraskedje-reaktion (PCR), digital PCR (dPCR), clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated with protein-9 (CRISPR-Cas9)-systemet och Next-Generation Sequencing (NGS) har utvecklats och testats under forskningsförhållanden med samma allmänna detektionsstrategi genom att rikta in sig på exon–exon-anslutningar av humana cDNA-sekvenser från EPO eller andra genetisk doping-relevanta gener (till exempel GH1, VEGF-A, FST och IGF-1). Gemensamt för de flesta av dessa tillvägagångssätt är dock antingen deras begränsade detektionspotential när det gäller antalet målbara exon–exon-anslutningar per reaktion (till exempl i fallet med qPCR och dPCR) eller deras kostsamma och tekniskt krävande tillämpning. Därför är mer omfattande och högpresterande testalternativ önskvärda.

Nu har utvecklats en ny högplexigengenpanel i samarbete med Agena Bioscience (San Diego, CA, USA) som möjliggör en multi-mål-detektionsmetod med användning av matrix-assisterad tidvågs laser-desorption/ionisation (MALDI-TOF) masspektrometri (MS) [24]. Den nya metoden är baserad på en 20-plex PCR-amplifieringssteg och en efterföljande single-base extension (SBE)-procedur med en slutlig detektionsfas med användning av MALDI-TOF MS.

Två produkter tillgängliga via internetbaserade leverantörer och marknadsförda som innehållande material med erytropoietin-gen och IGF1-gen analyserades för närvaro av potentiella gendopningsmedel med hjälp av en nyutvecklad analytisk metod. Denna metod möjliggjorde detektering av transgent DNA motsvarande sju potentiella proteiner (EPO, FST, GH1, MSTN (Propeptid), IGF1, VEGFA och VEGFD) genom en 20-plex polymeraskedjereaktion (PCR) följt av enkel basförlängning (SBE)-reaktion och efterföljande analys av SBE-produkter via matrix-assisterad tidvågs laser-desorption/ionisation masspektrometri (MALDI-TOF MS).

I den aktuella undersökningen analyserades två produkter från internetbaserade leverantörer för närvaron av potentiella gendopningsmedel med hjälp av en nyutvecklad multipel panel för gendopingtester. Två olika produkter (här benämnda EPO-P och IGF1-P), presenterade som formuleringar innehållande nukleinsyror lämpliga för förbättring av idrottsprestationer, beställdes via en webbsida. EPO-P beskrevs som en plasmid som kodar för EPO-gen, medan IGF1-P skulle innehålla en plasmid med IGF1-genen. EPO-P beskrevs dessutom som en syntetisk gen som, vid transkription, producerar funktionell erytropoietin och ger lokala och systemiska effekter. CpG-motiven inom plasmiden skulle också positivt stimulera kroppens immunsystem. Produkterna påstods vara “säkra” utan mutagena effekter på det mänskliga genomet. Båda produkterna skulle injiceras intramuskulärt vid en koncentration av 0,04–2,85 mikrog/kg för IGF1-P eller 1 mikrog/kg för EPO-P var femte dag.

Extrakt från båda produkterna visade sig innehålla transgent EPO-DNA, medan transgent DNA för IGF-1 inte detekterades. Resultaten bekräftades med SYBR Green qPCR med primer sets riktade mot EPO och IGF1 cDNA samt CMV-promotorsekvensen. I denna fallstudie rapporteras för första gången detektion av autentiska (om än lågkoncentrerade) transgener, potentiellt avsedda för gendopningspraxis, i kommersiellt lättillgängliga produkter [Referens: Naumann N, Passreiter A, Thomas A, Krug O, Walpurgis K, Thevis M. Analysis of potential gene doping preparations for transgenic DNA in the context of sports drug testing programs. Int J Mol Sci 2023; 24: 15835].

METODER FÖR FASTSTÄLLANDE DOPING MED ERYTROPOIETIN

Bestämning av erytropoietin i blod och urin

Röda blodkroppar (RBC) produceras i benmärgen genom stimulering av erytropoietin. Redan 1906 lade Paul Carnot och C. Deflandre fram bevis för att det måste finnas ett hormon som var ansvarigt för bildningen av röda blodkroppar (hematopoes) och gav den tänkta substansen namnet “Hematopoietin.”  1957 visade Leon O Jacobson, Eugene Goldwasser, Walter Fried och Louis F Plza att hematopoietinet producerades i njurarna och 1977 renade Takaji Miyake, Charles Kung och Eugene Goldwasser humant erytropoietin från myckt stora mängder urin från patienter med aplastisk anemi. 1983 klonades den humana erytropoietin-genen och 1989 godkände FDA det första läkemedlet med rekombinant humant erytropoietin för behandling av njurinsufficiensinducerad anemi.Erytropoietin produceras av levern fram till födseln. Efter födseln stimulerar hypoxi och anemi kraftigt, och renin-angiotensin-aldosteronsystemet (RAS) ökar erytropoietin-produktionen i njurarna något. Hormonella adjuvanser, inklusive androgener, aktiva vitamin D3-derivat och tillväxthormon, testades för att behandla njuranemi, men behandlingen har inte blivit populär på grund av begränsad effekt. Fram till användningen av erytropoesstimulerande medel (ESA) var blodtransfusion det huvudsakliga sättet att behandla patienter med njuranemi. ESA och Prolyl Hydroxylas Domain (PHD)-hämmare har i hög grad förändrat behandlingen av patienter med njurinducerad anemi. Stimuleringen av hypoxiinducerbar faktor (HIF) 2alfa och hämning av PHD2 orsakar en ökning av erytropoietinproduktionen i njurarna.Svårigheterna med att detektera erytropoietin genom Western blotting har förbättrats genom forskningsinsatser som delvis bekostats av WADA genom utveckling och  av detektions-metoderna.Utveckling av detektion av erytropoietinDetektion av erytropoietin genom Western blotting har varit svårt. Många rapporter under-sökte erytropoietin-mRNA-uttryck genom polymeraskedjereaktion (PCR) eller hybridisering in situ eller inkubationsmedium som substitut för erytropoietin. Innan den framgångsrika mätningen av erytropoietin med Western blotting, mättes erytropoietinnivåer i blod och urin med viss framgång med en enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) eller kemiluminescent enzymimmunanalys (CLEIA).Mätning av erytropoietinkoncentration i plasma utförs nu i stor utsträckning i klinisk miljö. Många antikroppar mot erytropoietin har framställt. Antikroppens specificitet har initialt kontrollerats genom biologisk aktivitet, främst med användning av radioisotoper. Rollen avglykosylering i den biologiska aktiviteten av erytropoietin har studerats omfattande. Gradvis avlägsnande av glukos från proteinet minskade efter hand den biologiska aktiviteten av erytropoietinin vivo, vilket tyder på betydelsen av glykosylering för den biologiskaaktiviteten av erytropoietin.För att detektera rekombinant erytropoietingenom natriumdodecylsulfatpolyakrylamid-gelelektrofores (SDS-PAGE) och Coomassie brilliant blue (CBB)-färgning i dessa studier krävdes en stor mängd rekombinant protein (några microg). Dessutom var mantvungnaatt rena proverna innan Western blotting.Isoelektrisk fokusering (IEF)-SIDADetekteringen av erytropoietin genom Western blotting har huvudsakligen utvecklats av WADA för att upptäcka illegal användning av ESA:er av idrottare. Urin var då vanligast använt. Det slående fyndet av användningen av IEF-PAGE var dock att endogent erytropoietin var surare än injicerat rekombinant erytropoietin, epoetin alfa och beta,epoetin-beta pegol (Continuous Erythropoietin Receptor Activator, CERA) och Epo-Fc (två mogna humana erytropoietinmolekyler kopplade till Fc-delen av humant IgG1).Dessutom visade sig NESP (New Erythropoiesis Stimulating Protein, darbepoetin alfa) vara mycketsurare än det endogena erytropoietinet.Natrium N-Lauroylsarcosinat (SAR)-PAGEWADA rekommenderade också en Western blotting-metod som använder SAR-PAGE för bättre differentiering av pegylerade erytropoietiner och ESAs. SDS-PAGE visar bättre differentiering av mindre ESA, såsom epoetin alfa, epoetin beta och Dynepo (epoetin delta). Känsligheten för SDS-PAGE för CERA minskar eftersom SDS binder till proteindelen av CERA och polyetylenglykol (PEG)-kedjan. Sarcosyl binder endast till proteindelen av CERA, och känsligheten är densamma med icke-PEGylerade epoetiner. SAR-PAGE-metoden används idag i antidopingsammanhang.Kapillärelektromigrationsmetoder

I denna metod kombineras i stället för SDS/SAR-PAGE ett kapillärelektroforessystemför Western blotting. Man har funnit att klonen AE7A5 är den bästa bland många monoklonala antikroppar. Denna kapillära Western blotting-metod är också en användbar metod för att detektera Epo-protein i både blod och urin.Vätskekromatografi/masspektrometri (LC/MS) analys

LC/MS-analys är ocksåett användbart verktyg för detektion av erytropoietin. Man kan använd LCMS-analys för att bekräfta att banden innehåller ertropoietin.

Deglykosyleringskopplad Western Blotting

Western blotting som rapporterats i många artiklar visar olika storlekar och former på banden. Den viktiga delen av WADA-rekommendationen är användningen av antikropps-klonen AE7A5. En annan viktig punkt är förrening av proverna. Förrening av proverna förbättrar kvaliteten på Western blotting. Det är dock inte lätt att utföra förrening avalla prover på grund av den höga kostnaden.Även om deglykosylering inte har blivit populärt, eftersom deglykosylering minskar den biologiska aktiviteten av erytropoietin, ökar det tillförlitligheten hos Western blot-resultaten.Metoder med deglykosylering-kopplad Western blotting

Serum och plasma kan användas som blodprov. Man använder vanligtvis 3–10 mikroL plasma eller serum. Eftersom urinkoncentrationen av erytropoietin är lägre än i blodet måste urinen koncentreras. Några ml urin räcker för att upptäcka erytropoietin om patienter har anemi.

Detektion av rekombinant erytropoietin och ESA

Humant och råttglykosylerad rekombinant erytropoietin visar ett brett band vid 28–47 kDa. Bandets bredd beror på mängden erytropoietin som laddas. Det deglykosylerade rekombinanta Epo-bandet är ett tunt band vid 22 kDa.ESA är större i storlek än endogent erytropoietin. Endogent erytropoietin i urindetekteras vid 35–38 kDa, och exogena ESA körs i en större storlek – epoetin alfa och beta vid 38–42 kDa, darbepoetin alfa vid 47–50 kDa och epoetin beta pegol (CERA) vid 93–110 kDa (CERA). Alla endogena eryropoietiner och exogena ESA förutom CERA skiftas till 22 kDa genom deglykosylering. Eftersom polyetylenglykol är bunden till CERA,,orsakar deglykosylering av CERA en liten förskjutning till 81–93 kDa [Referens: Yasuoka Y, Izumi Y, Sands JM, Kawahara K, Nonoguchi H. Progress in the detection of erythropoietin in blood, urine, and tissue. Molecules 2023; 28: 4446].

Metabol signatur av tillfört eytropoietin i blod och urin

Rekombinant humant erytropoietin (rHuEpo) är förbjudet enligt WADA. Syftet med denna studie var att identifiera en robust metabolom signatur för rHuEpo med hjälp av en longitodinell studie av blod (plasma och serum) och urin från 18 manliga deltagare som regelbundet ägnade sig åt främst uthållighetsbaserade aktiviteter, såsom löpning, cykling, simning, triathlon och lagsporter.

Varje deltagare fick 50 IU/kg kroppsvikt av rHuEpo subkutant varannan dag i 4 veckor. Prover samlades in vid baslinje, under rHuEpo-administrationen (under 4 veckor) och efter rHuEpo-administrationen (vecka 7-10). Proverna analyserades med hjälp av hydrofil interaktionsvätskekromatografi masspektrometri.

Avseende metabolomdata identifierades 488 plasmametaboliter, 694 serummetaboliter och 1628 urinmetaboliter. Reproducerbara signaturer av rHuEpo-administration i alla biovätskor inkluderade förändringar i pyrimidinmetabolism och acylcarnitiner (palmitoylcarnitin och elaidiskarnitin), metaboliska vägar som är förknippade med erytropoes respektive erytrocytmembranfunktion.

En metabolisk signatur av rHuEpo-administration identifierades således. Framtida studier kommer att krävas för att validera dessa resultat i oberoende kohorter och med ortogonala tekniker, såsom integration av data med signaturer härledda från andra “omics”-analyser av rHuEpo-administration (till exempel transkriptomik) [Referens: Lima G, Shurlock J, Wang G, Karanikolou A, Sutehall S, Pitsiladis YP, D’Alessandro A. Metabolomic profiling of recombinant erythropoietin (rHuEpo) in trained caucasian athletes. Clin J Sport Med 2023; 33: e123-34].

Erytropoietinmätning i Dried Blood Spots (DBS)

Missbruket av rekombinant erytropoietin (rEPO) och andra erytropoietin-receptoragonister (ERAs) inom idrotten har lett till behovet av känsliga detektionsmetoder för dessa substanser. Torkade blodfläckprover (Dried Blood Spots, DBS) erbjuder en enkel lösning för samtidig insamling av blod och urin under dopningkontroll, men känslighetsproblem framställs ofta som en utmaning för rutinmässig EPO-analys från DBS.

Dried Blod Spots potentiella användning för att detektera rEPO-mikrodoser och EPO-genvarianten c.577del behövde därför ytterligare bevisning. Här analyserades kapillärblod som samlats in från armhuden hos 111 idrottare med Tasso-M20 (17.5 mikroL/fläck), insamlat under professionella triathlon-tävlingar. Dessutom användes venösa blodprover från friska frivilliga för att förbereda flera fläckar om 20 mikroL på Mitra VAMS (från en studie om rEPO-mikrodoser) och Whatman filterpapper (från en studie om EPO-genvariant).

Immunopurifiering av två fläckar med MAIIA EPO Purification Gel Kit och analys med natrium N-lauroylsarkosinatpolyakrylamidgel-elektrofores (SAR-PAGE)/Western blot ledde till känslig detektion av

mikrodoser av rEPO från Mitra VAMS

endogen EPO från Tasso-M20 hos alla tävlande

EPO c.577del varianten från Whatman filterpapper

Dessutom detekterades endogen EPO från tävlande i DBS även när matchande urinprover hade omätbara EPO-nivåer. Sammanfattningsvis visar detta arbete att DBS kan vara en användbar kompletterande matris till urinprover för EPO-detektion.

Referens: Heiland CE, Martin L, Zhou X, Zhang L, Ericsson M, Marchand A. Dried blood spots for erythropoietin analysis: Detection of micro-doses, EPO c.577del variant and comparison with in-competition matching urine samples. Drug Test Anal 2023 Nov 9 [Online ahead of print].

Erytropoietinreceptoragonister (ERA:s) på DBS

Erytropoietinreceptoragonister (ERA:s) är ämnen som är förbjudna inom idrotten och som för närvarande analyseras i urin och blod. Det finns ett stort intresse för nya matriser som exempelvis torkat blod (DBS:s).

En direkt metod för detektion av ERA:s i DBS:s med endast en droppe på 25 mikroliter har optimerats och validerats. Detekteringsgränser nära eller likvärdiga de som krävs av WADA för serum/plasma uppnåddes med en volym 20 gånger lägre. Samtliga analyter var stabila i minst 90 dagar i rumstemperatur. Det drogs slutsatsen att metodens prestanda var jämförbar med kraven som fastställts för blodprov och därmed är övervakning av ERA:s tillförlitlig i DBS:s i dopingkontext [Referens: Requena-Tutusaus L, Anselmo I, Alechaga É, Bergés R, Ventura R. Achieving routine application of dried blood spots for erythropoietin receptor agonist analysis in doping control: low-volume single-spot detection at minimum required performance level. Bioanalysis 2023 Sep 7 [Online ahead of print].

Erytropoietinanaloger på läskpapper

Erytropoietin är ett hormon som efter injektion höjer blodvärdet vid blodbrist och därför har använts som ett bloddopingmedel. Farmakologiskt har hormonet manipulerats och den tredje generationens hormon kallas för Continuous erythropoietin receptor activator (CERA).

I visa situationer har det visat sig att torkat blod på ett läskpapper (Dried Blood Spots, DBSs), som är lättare att handskas med än blodprov, går att använda för testing i antidoping-sammanhang.

Det visades nu att DBS kan användas för bestämning av CERA med en metod som ger resultat på 2 timmar. Det användes då ett kommersiellt testsätt (”ELISA”) för analysen. Metoden gav korrekta resultat i upp till 20 dagar efter en injektion med CERA [Referens: Rocca A, Martin L, Kuuranne T, Ericsson M, Marchand A, Leuenberger N. A fast screening method for the detection of CERA in dried blood spots. Drug Test Anal 2021 Aug 11 (Epub ahead of print)].

Rekombinant erytropoietin med genvarianten c.577

Problem med felbedömning av rekombinant erytropoietin (rEPO) orsakat av varianten c.577del i den mänskliga EPO-genen har upptäckts under de senaste åren. Även om metoden för att analysera de-N-glykosylerade erytropoietiner (EPO) i blodprover utvecklades för att identifiera både EPO_p.Arg193AspfsTer28 (VAR-EPO) och rEPO, kan den inte tillämpas utan utvärdering av prover. För detta ändamål rekryterades fem heterozygota bärare av varianten c.577del i en administrationsstudie av rEPO.

Urin- och blodprover samlades in vid olika tidpunkter före och efter subkutan injektion med en engångsdos av 50 IE/kg. Urinproverna analyserades för intakt EPO, medan serum-proverna analyserades för både intakt och de-N-glykosylerad EPO. Ett typisk blandad band detekterades i alla tvättade urinprover, som alla visade ett liknande resultat som vid missbruk av rEPO. För analysen av intakt erytropoietin i serumprover detekterades ett typiskt blandat band i tvättade prover från dag 1 till dag 3, vilket kunde identifieras som rEPO direkt, medan ett dubbelband observerades i andra prover med tvetydiga resultat. Resultatet för de-N-glykosylerad EPO i alla serumprover visade två separata band, och förhållandet L/U minskade med tvättperioderna. Dessutom, jämfört med analysen av intakt EPO, erhölls ett längre detektionsfönster utan falskt positiva resultat vid analysen av de-N-glykosylerad EPO.

Analys av de-N-glykosylerad EPO kan inte bara direkt identifiera bärarna av varianten, utan också detektera doping med rEPO i blodprover från bärarna av varianten med högre effektivitet än analysen av intakt EPO [Referens: He S, Liu X, Song H, Zhou X. Administration study of recombinant erythropoietin on the carriers of variant c.577del in EPO gene. Drug Test Anal 2023 Aug 29 [Online ahead of print].

ERYTROPOIETINANALOGER

Roxadustat

Roxadustat, som säljs under varumärket Evrenzo® men som underforskningstiden betecknades som FG-4592, är ett läkemedel mot blodbrist. Det marknadsför i Norden av det Köpenhamnsbaserade företaget Astellas i Norden där företaget främst är verksamt inom sjukdomsområdena urologi, onkologi, transplantation, immunologi och nefrologi. I Sverige skall detta läkemedel bara sättas in av läkare med speciell kunskap och erfarenhet av den aktuella typen av blodbrist. Lämplig dosering är från 20 till 150 mg. Roxadustat fick sitt första globala godkännande i Kina den 17 december 2018, för behandling av blodbrist orsakad av kronisk njursvikt hos patienter som är beroende av dialys. Det godkändes i Japan 2019, för behandling av blodbrist orsakad av njursvikt hos patienter i dialys, och 2020 för patienter som inte är i dialys. Roxadustat godkändes för medicinsk användning i Europeiska unionen i augusti 2021.

Medicinen har nu blivit aktuellt genom att den rumänska tennisvärldstjärnan Simona Halep, 31 år gammal, har fastnat i ett dopningstest, enligt tennisens antikorruptionsorgan ITIA i ett meddelande från den 21 oktober 2022. Dopingtestet togs under US Open 29 augusti till 11 september. I oktober 2017 nådde Halep positionen som världsetta för första gången och hon har vunnit både Wimbledon och Franska öppna mästerskapen. I oktober 2022 är hon nummer 9 på världsrankingen 9, och hon är den högst profilerade tennisspelaren som testat positivt för doping sedan Maria Sharapova sex år tidigare. Halep riskerar nu fyra års avstängning.

WADA har klassificerat roxadustat i grupp S1, 1. Erythropoietins (EPO) and agents affecting erythropoiesis, tillsammans med kobolt, daprodustat, molidustat, vadadustat och xenon. Roxadustat är specfikt omnämnt på WADAs förbjudna lista sedan 2915, men kunde sannolikt definieras som en dopingsubstans under benämningen ”hypoxia-inducible factor (HIF) stabilizers and activators (e.g. xenon, argon)” vilken är förbjuden sedan 2011.

Ett första dopingfall med roxadustat som dokumenterats i den vetenskapliga litteraturen kom 2016 [J Pharm Biomed Anal 2016; 121: 181-7].

Roxadustat är en HIF-prolyl-hydroxylas-hämmare (HIF-PHI) som ökar endogen produktion av erytropoietin och stimulerar produktionen av hemoglobin och röda blodkroppar. Det skiljer sig från erytropoietin och flertalet av dess analoger genom att medicinen tas genom munnen (behöver inte injiceras). Tabletterna är avsedda att ersätta exempelvis de injektionskrävande medicinerna Darbepetin alfa, Epotein och Medoxipolyetylenglykol-epoetin alfa.

Under evolutionen har mekanismer utvecklats för att säkra den livsviktiga syretillförseln. Karotiskroppen, belägen i anslutning till halsens stora blodkärl, innehåller specialiserade celler som kan känna av blodets syrenivåer och aktivera de nervbanor som styr vår andning. 1938 års Nobelpris i fysiologi eller medicin belönade Corneille Heymans för upptäckter kring hur blodets syrenivåer kan avläsas och styra vår andningsfrekvens. Utöver den snabba anpassningen styrd från karotiskroppen vid låga syrenivåer (hypoxi) sker en mer långsam anpassning i kroppens celler. Bland annat ökar nivåerna av hormonet erytropoietin (EPO) som stimulerar nybildning av röda blodkroppar och därmed ökar blodets syretransporterande förmåga. Erytropoietin har ju använts som ett dopingmedel i uthållighetsidrotter mer allmän i cirka 25 år.

Nobelpriset i fysiologi eller medicin år 2019 delades lika mellan William G. Kaelin, Sir Peter J. Ratcliffe och Gregg L. Semenza för deras upptäckter om hur bildningen av erytropoietinet kan påverkas. Man visade att EPO-genen aktiveras av ett proteinkomplex som binder till DNA-segmentet på ett syreberoende sätt. Proteinet kallade för hypoxia-inducible factor (HIF). Ett omfattande reningsarbete visade 1995 att HIF består av två olika DNA-bindande proteiner, så kallade transkriptionsfaktorer, som nu benämns HIF-1alfa och ARNT.

Vid höga syrenivåer innehåller cellerna mycket lite HIF-1alfa. Då syrenivåerna däremot är låga ökar mängden så att HIF-1alfa kan binda till och därmed reglera EPO-genen och andra gener som har HIF-bindande DNA segment. Flera forskargrupper visade att HIF-1alfa normalt bryts ner mycket snabbt men att proteinet skyddas från nedbrytning och anrikas vid låga syrehalter (hypoxi). Ett cellulärt maskineri kallat proteasomen, belönat med 2004 års Nobelpris i kemi till Aaron Ciechanover, Avram Hershko och Irwin Rose, används för att bryta ner HIF-1alfa vid normala syrenivåer. Under sådana normala betingelser adderas en liten peptid, ubiquitin, till HIF-1alfa. Ubiquitin fungerar som en adresslapp för de proteiner som ska brytas ner i proteasomen.

Man visade sedan att en syreatom adderas till två specifika positioner i HIF-1alfa vid normala syrenivåer. Denna förändring, som benämns prolyl-hydroxylering, gör att ett annat protein (VHL) kan känna igen och binda till HIF-1alfa. Upptäckten förklarade således hur olika syrenivåer kan styra nedbrytningen av HIF-1alfa.

Aktiviteten hos HIF-hämmande enzymer styr de intracellulära nivåerna av HIF, en transkriptionsfaktor som reglerar uttrycket av gener som är inblandade i erytropoes. HIF-aktiveringen är viktig för det adaptiva svaret på hypoxi för att öka produktionen av röda blodkroppar. Genom reversibel hämning av HIF-hämmare stimulerar roxadustat ett samordnat erytropoetiskt svar som innefattar en ökning av de endogena erytropoetin-nivåerna (EPO) i plasma, reglering av järntransportproteiner och en sänkning av hepcidin (ett järnregleringsprotein som ökar under inflammation vid kronisk njursjukdom). Detta leder till bättre biotillgänglighet för järn, ökad Hb-produktion och ökad erytrocytvolym.

Maximal plasmakoncentration (Cmax) uppnås vanligtvis 2 timmar efter dos i fastande tillstånd. Administrering av roxadustat tillsammans med mat minskade Cmax med 25 procent. Oförändrat roxadustat är den främsta cirkulerande komponenten i human plasma; ingen detekterbar metabolit i human plasma utgjorde mer än 10 procent av den totala läkemedelsrelaterade exponeringen och inga humanspecifika metaboliter observerades. Den genomsnittliga effektiva halveringstiden (t1/2) för roxadustat är cirka 15 timmar hos patienter med kronisk njursjukdom. När radiomärkt roxadustat administrerades oralt till friska personer var medelvärdet för återfunnen radioaktivitet 96 procent (50 % i faeces, 46 % i urin). I faeces utsöndrades 28 procent av dosen som oförändrat roxadustat. Mindre än 2 procent av dosen återfanns i urin som oförändrat roxadustat.

Fler avstängningar för Roxadustat

Roxadustat (under forskningstiden benämnt FG-4592) är en förening som stimulerar produktionen av erytropoietin (EPO) inuti kroppen (endogen). Till skillnad från exogent (externt tillfört) EPO är det tillgängligt i tablettform -vilket är en väsentlig framgång för de sjuka som måste ta medicinen regelbundet, främst cancersjuka och patienter med njursvikt – och verkar för att verka mot blodbrist genom att öka en individs förmåga att producera röda blodkroppar.

Substansen blev nyligen aktuell då tidigare världsetta i tennis, Simona Halep, påvisades ha substansen i ett dopingprov. Hon har förklarat att hon inte har dopat sig och att hon inte vet hur substansen kunnat påvisas i hennes dopingprov.

Tidigare domar tyder dock på att hon kan möta svårigheter. I augusti 2016 avstängde Union Cycliste Internationale (UCI) chilenaren Carlos Oyarzun i fyra år, över ett år efter att han testats positivt för FG-4592. Den 29 juli 2014 stängde UCI av Androni Giocattoli-Sidermec Pro Continental-teamet i 30 dagar, efter att föraren Fabio Taborre rapporterat ett positivt analytiskt fynd för FG-4592. Han dömdes senare till fyra års avstängning. I april 2014 bekräftade den franska antidopningsmyndigheten (AFLD) att Bertrand Moulinet hade testat positivt för FG-4592. Gångaren fick fyra års avstängning ett år senare.

Reblozyl

Luspatercept (Reblozyl®) är ett nyligen godkänt läkemedel mot anemi som är förbjudet av

WADA. Det främjar erytropoes genom att begränsa apoptos av omogna erytroblaster och

risken för missbruk av idrottare för dopning är hög. Föreslagna detektionsmetoder har

publicerats nyligen men endast utvärderats in vitro. Syftet med denna studie var att utföra

den första administreringen av luspatercept till friska frivilliga i antidopningssyfte och att

utvärdera detekterbarheten i serum, torkade kapillärblodfläckar (DBS, insamlade med hjälp

av TASSO M20-apparat) och urin. Indirekt detektion utvärderades också genom att

analysera hematologiska parametrar för det biologiska passet för idrottare.

Fyra frivilliga (två män, två kvinnor) fick en subterapeutisk dos av luspatercept (0,25 mg/kg)

följt 3 veckor efter av en andra dos. Prover samlades från före administrering till 7 veckor

efter den andra dosen. Efter immunrening, elektroforetisk separation SDS-/SAR-/IEF-

polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) och immunodetektion, upptäcktes luspatercept i höga

nivåer i serum fram till slutet av insamlingen, tecken på en mycket långsam eliminering och

detekterades på liknande sätt oförändrad vid lägre nivåer i urinen från 2 dagar efter den

första administreringen till 7 veckor efter administreringen. DBS visade också samma långa

detektionsfönster.

Luspatercepts effekter var dock av begränsad amplitud på hematologiska markörer, och

endast två försökspersoner visade atypiska punkter utanför de fysiologiska gränserna under

studien. Den direkta detektionsmetoden är mycket effektiv och byte av elektroforetisk metod

och detektionsantikropp kan användas för att bekräfta misstänkta prover [Referens: Marchand A, Miller G, Martin L, Gobbo C, Crouch AK, Eichner D, Ericsson M.

Detection of erythropoiesis stimulating agent Luspatercept after administration to healthy

volunteers for antidoping purposes. Drug Test Anal 2022; 14: 1952-61].

METODER FÖR ATT UPPTÄCKA BLODDOPING

Tekniker för upptäckt av bloddoping inom idrotten ur 1988 års perspektiv

Ökad prestanda efter blodtransfusion demonstrerades för första gången på 1950-talet, men tekniken väckte inte uppmärksamhet förrän i början av 1970-talet då den kallades “bloddopning” av media. Ingreppet kan öka både maximal syreupptagning (V̇O2max) och prestation inom uthållighetsidrotter. Det förbjöds av Internationella olympiska kommittén (IOC) efter OS 1984, trots att inga metoder hade utarbetats för entydig upptäckt.

En önskad effekt av bloddopning är den ökade totala massan av röda blodkroppar som leder till ökningar av hemoglobin, som efter framgångsrikt inducerad bloddopning är i storleks-ordningen minst 10 procent. Dessutom leder lagring av blod till en konstant minskning av RBC-antalet på grund av RBC:s begränsade livslängd (hemolys). Därigenom kommer serumjärn- och bilirubinnivåerna att öka och nå maximala nivåer inom den första dagen. Hemolys är mer accentuerad efter lagring av blod i en blodbank än i fruset tillstånd. Regleringen av RBC-bildningen förmedlas genom en negativ återkopplings-mekanism via glukoproteinhormonet erytropoietin. Bloddopning, åtminstone med blod förvarat i kylskåp, inducerar en minskning av erytropoietinnivåerna i serum med cirka 62 procent en dag efter bloddopning. Därefter förblir erytropoietinnivåerna i serum väsentligen desamma i 4 veckor.

För att upptäcka bloddopning hos en individ måste flera faktorer beaktas. Blodprov krävs och måste tas efter en viloperiod på minst 12 timmar. Detektering av bloddopning På grund av avsevärd variation inom normalpopulationen kan inte en enda parameter ensam detektera bloddopning, och därför är en algoritm baserad på ändring av 2 eller fler parametrar (ökning av hemoglobin och serumjärn och bilirubin, minskning av serumerytropoietin) nödvändig. I dagsläget finns det indikationer på att bloddopning (förvarat blod i kylskåp) kan upptäckas hos cirka 50 procent av de bloddopade idrottarna under de första 2 veckorna. Den föreslagna metoden är baserad på analys av skillnader i hemoglobin- och erytropoietinnivåer i serum mellan 2 blodprov tagna med ett minimalt intervall på 1 till 2 veckor [Referens: Berglund B. Development of techniques for the detection of blood doping in sport.

Sports Med 1988; 5: 127-35].

Nytt sätt att beräkna retikulocytkoncentration på DBS vid bloddoping

En av de viktigaste parametrarna i blodpasset är koncentrationen av reticulocyter, det vill säga de röda blodkroppar som är upp till ett dygn gamla i cirkulationen och därigenom speglar nybildningshastigheten för de röda blodkropparna. I mikroskopet framträder de cellkärnerester av ribosomalt RNA som ett nät (”reticulum”) med hjälp av färgning med exempelvis metylenblått. Fram till idag har man beräknat koncentrationen reticulocyter med automatiska räknare av röda blodkroppar där reticulocyterna urskiljts genom en kombination av laserexitering, färgning av RNA och DNA och speciella detektorer.

Det har nu tagits fram en alternativ metod för retikulocytbestämning som lämpar sig bra för DBS (Dried Blood Spot). Man använder två proteiner som i blod bara finns i reticulocyterna, CD71 och ferrochelatase (FECH), och en som finns i alla röda blodkroppar, Band 3.

Man testade nu metoden genom att ge låga doser EPO (40 IU/kg rhEPO) eller koksalt-lösning till 20 friska personer. De genomsnittliga kvoterna CD71/Band 3 och FECH/Band 3 ökade med 412 ± 197 respektive 250 ± 44 procent medan den biomarkör som idag används i blodpasset, RET%, ökade med 195 ± 35 procent. Vid undersökning dag 35 och dag 39 ökade CD71/Band 3 relativt koksaltlösning med 127 ± 25 och 139 ± 36 procent medan man inte såg någon ökning alls av RET%. CD71/Band 3 förblev under 75 procent av baslinje-värdet under minst 4 veckor efter erytropoietininjektionen, medan RET% återgick till baslinjen.

Den refererade metoden förefaller vara ett bättre sätt att mäta reticulocytkoncentrationen på, åtminstone om man använder DBS [Referens: Cox HD, Miller GD, Manandhar A, Husk JD, Crouch AK, Eichner D. Tracking immature reticulocyte proteins for improved detection of recombinant human erythropoietin (rhEPO) abuse. Am J Hematol 2021 Oct 9 [Epub ahead of print].

Indirekta biomarkörer för bloddopning

Bloddopning i dess olika former är dessvärre fortfarande en aktuell fråga inom idrotten och en pågående utmaning för antidopingforskningen. Inledningsvis hade man fokus på direkta detektionsmetoder för att identifiera tecken på tillfört blod eller dess metaboliter, men idag har antidopinginsatsen successivt kompletterats med indirekta tillvägagångssätt. Den longitudinella och individuella övervakningen av specifika biomarkörer syftar till att identifiera icke-fysiologiska variationer som kan vara relaterade till dopning.

Ur detta perspektiv är identifieringen av markörer som är känsliga för erytropoesförändring nyckeln i screeningen av bloddopning. Det nuvarande biologiska idrottspasset som implementerats sedan 2009 består av 14 variabler (inklusive två primära markörer, det vill säga hemoglobinkoncentration och OFF-poäng) för den hematologiska modulen som ska användas för indirekt detektering av bloddopning.

Forskning har sedan införandet 2009 upprepat undersökt nya markörer som är känsliga för en förändring av den erytropoetiska kaskaden och specifika för bloddopning. När nu flera tidiga markörer har identifierats (på transkriptomisk nivå) eller utvecklats direkt i en diagnostiksats (på en proteomisk nivå), kan andra målvariabler i slutet av den erytropoetiska processen (kopplade med de röda blodkropparnas funktioner) förstärka hematologisk modul i framtiden.

Nuvarande status och de framtida möjligheterna föranleder denna systematiska genomgång [Referens. Krumm B, Saugy JJ, Botrè F, Donati F, Faiss R. Indirect biomarkers of blood doping: A systematic review. Drug Test Anal 2023 May 9 [Epub ahead of print].

Cirkulerande extracellulära vesiklar av röda blodkroppar efter blodtransfusion

Syftet med en pilotstudie var att undersöka effekterna av transfusion av ett erytrocyt-koncentrat på antalet cirkulerande extracellulära vesiklar av röda blodkroppar (RBC-EV) och deras rensningstid. Sex friska frivilliga donerade sitt blod och transfunderades med sitt RBC-koncentrat efter 35-36 dagars förvaring. Ett K2EDTA- och ett serumprov togs före donation, vid fyra tidpunkter efter donation och vid ytterligare sex tidpunkter efter transfusion. RBC-EV: er analyserades på en Cytek Aurora flödescytometer. En mycket signifikant ökning (p < 0,001) av RBC-EV från ett genomsnitt på 60,1 ± 19,8 (103/μL) vid baslinjen till 179,3 ± 84,7 (103/μL) under de första 1-3 timmarna efter transfusion kunde observeras. Individuella skillnader i svaret på transfusion blev uppenbara med en volontär som inte visade någon ökning och en annan en ökad koncentration vid en tidpunkt efter donation på grund av en influensa-infektion. Man drog slutsatsen att i en individualiserad passtrategi kan ökade RBC-EV:er betraktas som ytterligare bevis vid tolkning av misstänkta idrottares biologiska pass (ABP), men för detta skulle ytterligare forskning relaterad till provinsamling och transportprocesser samt metodutveckling och harmonisering vara nödvändig [Referens: Voss SC, Yassin M, Grivel JC, Al Hmissi S, Allahverdi N, Nashwan A, Merenkov Z, Abdulla M, Al Malki A, Raynaud C, Elsaftawy W, Al Kaabi A, Donati F, Botre F, Mohamed Ali V, Georgakopoulos C, Al Maadheed M. Red blood cell derived extracellular vesicles during the process of autologous blood doping. Drug Test Anal 2022; 14: 1984-94].

Effekterna av järninjektion på bloddopningsbiomarkörer i DBS

Järntillskott betraktas inte som en dopningsmetod men det kan påverka nivåerna av flera biomarkörer i den hematologiska modulen i det biologiska idrottspasset (ABP), såsom retikulocytprocenten (%RET) och hemoglobinnivån (Hb). Järninjektion kan alltså vara en faktor vid antidopinganalyser som gör resultaten mer svårtolkade.

Tidigare studier har föreslagit att Hb-nivån och expressionsnivåerna av retikulocytrelaterade mRNA, såsom 5’-aminolevulinatsyntas 2 (ALAS2) och kolsyraanhydras 1 (CA1), kan vara lovande biomarkörer för ABP och detekterbara i fläckar av torkat blod (DBS). Därför undersökte man i denna studie effekten av järninjektion på nivåerna av dessa potentiella biomarkörer i DBS.

Retikulocytrelaterade mRNA-analyser utfördes med RT-qPCR. Ferritinnivån i DBS mättes med enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) metod. Noterbart fanns det inga signifikanta effekter av järntillskott på nivåerna av ALAS2 och CA1 mRNA, men däremot ökade %RET och omogna retikulocytfraktion (IRF) mätt i helblod signifikant efter järninjektion. Som förväntat ökade järntillskott ferritinnivån signifikant i både serum- och DBS-prover.

Sammanfattningsvis förstärker dessa fynd specificiteten hos retikulocytrelaterade mRNA:er i DBS:er som biomarkörer för bloddopning till mål i antidopinganalyser. %RET och omogna retikulocytfraktioner (IRF) mätt i helblod ökade signifikant efter järninjektion. Som förväntat ökade järntillskott ferritinnivån signifikant i både serum- och DBS-prover [Referens: Loria F, Maret E, Schobinger C, Kuuranne T, Grabherr S, Leuenberger N. The effects of iron injection on blood doping biomarkers in dried blood spots. Drug Test Anal 2023; 15: 444-8].

Hemoglobin-based oxygen carriers (HBOC:s)

Sandmaskhemoglobin som HBOC

Syrgasen bärs normalt i blodet av hemoglobinet i de röda blodkropparna från lungorna till de arbetande cellerna. Artificiellt kan man ur blod rena hemoglobinet från resten av de röda blodkropparna och använda det renade hemoglobinet som konstgjorda blodbärande molekyler utan antigena egenskaper, vilket kan vara en god lösning exempelvis vid situationer då det krävs mycket blod (man behöver inte bekymra sig om blodgrupperna). Exempel på det är stora blödningar vid kirurgi och trafikolyckor och inte minst under krigsförhållanden då hemoglobinlösningarna kan förvaras lättare än helblod.

Hemoglobinlösningarna kallas för hemoglobin-based oxygen carriers (HBOCs), och kan naturligtvis också användas för bloddoping. Därför ingår denna typ av lösningar i WADAs ”Förbjudna listan” enligt sektion M1, Manipulation of Blood and Blood Components .

Sedan den 1 april 2021 är det obligatoriskt för WADA-ackrediterade laboratorier att också analysera för HBOCs i alla blodprov, inkluderande blodpassen. Dessvärre uppstod viss förvirring efter det att WADA gjort analysen obligatorisk men inte meddelade detta officiellt, vilket ställt till bekymmer – det är nu dock tillrättalagt.

Under senare tid har det tillkommit en lång rad kommersiellt tillgängliga HBOCs, exempelvis hemoglobin utvunnet ur sandmasken (Arenicola marina), Hemarina® – sandmaskgångar och deras små sandslott kan man se på de flesta havssandstränder i Sverige. WADA har introducerat screeningmetoder för HBOCs och ett system där sedan vissa laboratorier kan ta hand om den exakta substansbedstämningen enligt ISO/IEC 17025.

WADA medger nu att det finns flera ytterligare problem som ännu inte fullt ut adresserats:

Vid blodpass har man inte ett A- och ett B-prov

Om det är hemolys i blodprovsrören kan HBOC-bestämningar inte göras

Positiva HBOCs i blodpass kan inte registreras i WADA:s Anti-Doping Administration Management System (ADAMS), vilket är det sätt man för närvarande rapporterar avseende hematologimodulen

På grund av dessa problem har WADA beslutat att tills vidare bara genomföra HBOC-analyser vid speciella tillfällen, det vill säga på samma sätt som före den 1 april 2021.

Borstmaskhemoglobin som HBOC

Blodtransfusioner och hemoglobinbaserade syrebärare (HBOCs) användas för att konstgjort förbättra blodets syretransportkapacitet, men manipulation av blod och blodkomponenter inom idrotten är alltid förbjudet enligt WADA. De flesta läkemedelskandidater baserade på stabiliserat hemoglobin (Hb) har visat sig vara förknippade med allvarliga biverkningar, men det naturliga gigantiska extracellulära Hb från marina invertebraten Arenicola marina (borstmask) kan vara en ny kandidat för transfusionsmedicin och fuskande idrottare, eftersom det visat sig vara väl tolererat i prekliniska djurstudier.

Inom ramen för ett forskningsprojekt implementerades borstmask-Hb i den befintliga detektionsmetoden för dopningstester för bovina HBOCs baserad på ultrafiltrering, tryptisk digestion och vätskekromatografi kopplad med högupplöst tandemmasspektrometri (LC-HRMS/MS). För masspektrometrisk identifiering av borstmask-Hb användes två föregångar-produktjonpar för sammanlagt fyra tryptiska peptider som härstammar från subenheter hbA2 (T6), hbB1 (T3 och T6) och länkarkedjan (T16). Den modifierade metoden karakteriserades omfattande och visade sig möjliggöra för specifik och känslig detektion av borstmask-Hb ned till koncentrationer av 10 μg/mL från 50 μL serum/plasma. Därför kan den tjäna som bekräftelseförfarande för borstmask-Hb efter visuell eller elektroforetisk screening.

Dessutom utfördes en “proof-of-concept”-studie med råttor, och de observerade detektionsfönstren på minst 4 timmar (dos: 200 mg/kg) och 8 timmar (dos: 600 mg/kg) antyder att metoden kan användas effektivt för att testa dopingkontrollprover under tävling för närvaron av läkemedelskandidaten ]Referens: Walpurgis K, Gäde A, Thomas A, Gochard S, Delahaut P, Thevis M. Detection of extracellular hemoglobin from Arenicola marina in doping control serum samples by means of liquid chromatography and high-resolution tandem mass spectrometry. Drug Test Anal 2023 Nov 2 [Online ahead of print].

INDIVIDUELL BLODDOPINGHISTORIA

Höga blodvärden på 90-talet i längdskidåkning

”Blodvärdet”, Hb, brukar man kalla koncentrationen av hemoglobin i blodet. Blodvärdet brukar mätas i gram per liter och ett normalt värde för en man anges ofta till cirka 130-170 g/L och för en kvinna 120-155 g/L. Referensvärdena skiljer sig några procent mellan olika laboratorier beroende på vilken apparatur som används och hur man valt ut ”normalpersonerna.”

När man diskuterat bloddoping – i dess olika former – har hemoglobinvärdet kommit i fokus. Bland de längdskidåkare i elitklass som på 1990-talet har känd, höga hemoglobin-koncentrationer (Hb) som offentliggjort finns:

Vladimir Smirnov, Kazakstan198

Silvio Fauner, Italien192

Jukka Hartonen, Finland178

Björn Dählie, Norge175

Lars Håland, Sverige175

Manuela Di Centa, Italien173

Erling Jevne, Norge170.

Marit Mikkelsplass, Norge161

Före 1996 fanns inga särskilda Hb-gränsvärden för längskidåkare. Prover togs, men ingen riskerade avstängning – höga blodvärdena var inte klassade som doping, även om det var känt redan då att de högsta Hb-värdena endast kunde uppnås på artificiell väg.

I flertalet fall gavs idrottarna förklaringar om att värdena skulle bero på höghöjdsträning eller boende på hög höjd. Som mest höjs dock hemoglobinvärdet endast med 10-15 enheter genom att utsätta sig för höghöjdsträning och de som under 2000-talet sedan tränat på hög höjd har aldrig haft så höga värden.

Fysiologiprofessorn och dopningsexperten Bengt Saltin menade att ett skidmästerskap är ”smutsigare” än alla andra ur dopningssynpunkt – VM i Thunder Bay 1995. Ett VM där superstjärnor som Björn Dählie, Vladimir Smirnov och Silvio Fauner skördade stora framgångar. Enligt uppgifter Bengt Saltin presenterade ska alla medaljörer från VM 1995 haft blodvärden över 175. Det är över den gräns som skidförbundet sedan tillämpade under många år för att längskidåkare skulle få starta – det sas att det var för idrottsutövarnas hälsas skull, men mer sannolikt var det nog eftersom man inte på ett juridiskt godtagbart sätt kunde fastställa bloddoping. För att få bukt med de höga blodvärdena sattes således en gräns 1996 för blodets Hb-värden till 160 för kvinnor och 175 för män. Männens gränsvärden sänktes sedan 2003 från 175 mg/L till 170. Kvinnornas gränsvärden hölls kvar på samma nivå, 160 mg/L.

Mest utmärker sig under denna tidsperiod kanske Vladimir Smirnov, från Kazakstan. Han blev den store VM-kungen med tre guld och en bronsmedalj. Han hade också det absolut högsta blodvärdet av de som testades, 198.

Torgny Mogren, framgångsrik landslagsåkare från mitten av 80-talet till 1998, berättade från tävlingen i Lahtis 1997 som var första gången man blodtestade alla åkarna. ”Det allmänna snacket var ju att jaha, nu är det många som har åkt dit. Det var en märklig tävling, folk strök sig och åkte omkull och det var alla möjliga konstiga saker som hände.”

Blodvärdena från 1990-talet kan jämföras med senare perioders blodprov. Per Elofsson var skidåkare i elitklass 1998-2007 men hade exempelvis blodvärden mellan 145-155. De svenska landslagsåkarna hade 2013 för män Hb på lägst 136 och högst 177 och för kvinnor 119-154.

2018 redovisades i ett uppmärksammat TV-reportage att Internationella Skidförbundet har en databas om minst 2000 blodprover på elitskidåkare. Av dessa är det 70 åkare med höga blodvärden som tillsammans vunnit över 300 medaljer (nästan 100 av dem var guld). Det land i databasen med flest åkare som utmärker sig med höga värden var inte oväntat Ryssland med 51 stycken. Tyskland, Frankrike och Österrike följer därefter. I Norge fanns 16 åkare med blodvärden som, enligt forskning, bara 1 på 100 kan ha på naturlig väg. I Finland 15. Här fanns också åkare från Estland, Tjeckien, Italien, Spanien, USA och Kanada. I Sverige var det 12 åkare med höga värden. Nästan hälften av åkarna som vunnit medaljer i VM eller OS från 2001 och fram till 2018 hade någon gång haft misstänkt höga blodvärden.

USA:s cyklisters bloddoping vid OS 1984

I januari 1985 avslöjades det offentligt att ett antal cyklister i det amerikanska olympiska laget hade mottagit blodtransfusioner under OS 1984 i ett försök att förbättra sina tävlingsresultat (vinna medaljer). Detta anmärkningsvärda projekt möjliggjordes av personal från United States Cycling Federation (USCF).

Bakgrund

Medicinsk litteratur var tillgänglig 1984 avseende fysiologiska effekter av bloddoping sedan åtminstone 30 år. Grundidén är enkel. En idrottare får blod utdraget, en halv till en hel liter, och sedan separeras de röda blodkropparna från resten av blodet och fryses. Lämpligt är att tappa minst en och en halv månad innan en viktig tävling. Idrottarens kropp kommer att ersätta detta blod under den mellanliggande perioden, och sedan, strax före loppet, tinas det frusna blodet och återinfunderas i idrottaren för att höja antalet röda blodkroppar. Blodtrans-fusionen förbättrar blodets syrekapacitet, vilket kan öka prestationsförmågan i främst uthållighetsidrotter.

Internationella olympiska kommittén (IOC) verkade länge ha varit obekväm med blodtransfusioner men valde att inte göra något åt ​​det, åtminstone delvis på grund av att det inte fanns någon praktisk möjlighet att testa för det på ett juridiskt godtagbart sätt. Sålunda fortsatte bloddopingen utan någon reell risk att bli avslöjad.

Ett lyft för cyklingskapaciteten

Ett förslag om att prova blodtransfusioner för amerikanska cyklister initierades 1983 av Ed Burke, som hade en doktorsexamen i fysiologi och som hade fått en position i US Cycling Federation-staben. Därifrån blev han invald i USCF:s styrelse och använde den plattformen för att få stöd för sin forskning och för att senare agera så att han fick en fast tjänst i USCF under förutsättning att han senare skulle avgå ur styrelsen.

1983 kontaktade Burke USOC-personalen (den amerikanska Olympiska Kommittén) med ett förslag om att prova blodtransfusioner. USOC svarade att den var intresserad av att prova metoden om USCF:s styrelse godkände projektet. Burke sökte internt stöd men fann liten entusiasm. I ett memo daterat 1 oktober 1983 från verkställande direktören Dave Prouty, blev Burke tillsagd att inte fortsätta med detta projekt om det inte godkändes av styrelsen. Något godkännande begärdes dock aldrig av styrelsen.

När OS närmade sig bestämde sig en cyklist vars svärfar råkade vara läkare för att göra ett försök på egen hand. Danny van Haute gjorde sedan överlägsna insatser under Olympic Selection Races och tillskrev sin framgång blodtransfusionerna. Den nationella tränarstaben och några andra cyklister blev plötsligt intresserade av detta upplägg och började planera för att också använda det. De bestämde sig dock för att hålla det hemligt för de flesta av USCF:s styrelse och personal, uppenbarligen för att de trodde att det kunde blockeras om de var redovisade försöken öppet. Arkitekterna bakom detta program var nationell tränare Eddie Borysewicz, fysiologen Ed Burke och vicepresident Mike Fraysse.

Det största problemet med bloddopingsschemat var att det inte fanns tillräckligt med tid för att tappa ut blod från varje idrottare och låta dem fylla på det fullt ut vid tiden för OS. Ett alternativt upplägg togs fram och man planerade för att använda transfusioner från vänner och släktingar istället. Beslutet var inte bra av tre skäl:

det diskuterades aldrig ur etiksynpunkt

den planerade transfusionen av en enhet blod per cyklist var otillräcklig för att förbättra prestandan signifikant

transfusioner av andras blod, gjort utanför sjukvårdens säkerhetsrutiner, innebär avsevärt större risker än självinfusioner (det fanns exempelvis inget test för AIDS eller hepatits C vid denna tidpunkt)

Ed Burke ordnade så att läkaren Herman Falsetti, en kardiologbekant till honom från universitet i Iowa, skulle komma någonstans i närheten av OS-byn för att administrera transfusionerna. Falsetti var själv tävlingscyklist. Hans deltagande i detta projekt illustrerar det faktum att vilken oetisk medicinsk procedur man än skulle vilja vidta, kan man förmodligen hitta en läkare som är villig att göra det, särskilt om det uppges vara för en ädel sak som att vinna olympiska medaljer.

Ett antal cyklister övertalades att ta transfusioner, vilka gavs i sovrummen på Ramada Inn i Carson, Kalifornien. De borde ha föregåtts av noggranna blodkompatibilitetstester, men detta gjordes tydligen inte. Dr Falsetti avtalade dock med ett lokalt sjukhus att testa blodtyperna. Redogörelsen som gavs till sjukhuset var att den storskaliga blodtestningen genomfördes i händelse av en terroristattack mot idrottarna!

Eftertankens kranka blekhet

Cyklisternas misslyckade bloddoping – det är inte troligt att de små mängderna blod signifikant uppvägde problemen vid OS 1984 – blev relativt snabbt avslöjade. Meddelaren var en person som endast var perifert involverad i projektet, men han hyllades till en början för att han trädde fram. Det blev emellertid senare uppenbart att hans agerande motiverades mindre av altruism än av en önskan att dölja sina egna förseelser.

När blodtransfusionsincidenterna blev kända för USCF-representanter såg några av dem det som ett problem att hantera, medan andra såg det som en politisk möjlighet. Rob Lea hade valts till president för USCF ungefär åtta veckor efter OS 1984, efter en kampanj som innehöll en attack mot den sittande presidenten, Phil Voxland. En viktig del av attacken var en broschyr som skrevs och distribuerades av en kontraktsanställd i idrottsförbundet (Jim McFadden) som uppenbarligen försökte skydda sitt jobb. Lea var en framstående cyklist i åldersgruppen 35+. Han hade en Ph.D. och var praktiserande psykolog. Han var också en skicklig manipulator. Ett av hans kampanjlöften hade varit att han skulle sparka verkställande direktören, Dave Prouty, som hade motstått manipulation av Lea och hans kollegor.

Efter att han vunnit presidentskapet upptäckte Lea snabbt att han inte hade det stöd han behövde inom den verkställande kommittén för att sparka Prouty. Inför verkligheten gick han mycket smidigt över till att förhandla om en förnyelse av Proutys kontrakt, som om ingenting hade hänt. I mitten av november 1984, ungefär en månad efter att Lea tillträdde, fick han en rapport från en person i den amerikanska olympiska kommitténs medicinska personal angående en ung ortopedisk kirurg vid namn Tom Dickson, som hade arbetat med USCF-landslaget och var intresserad inom idrottsmedicin. Dickson hade klagat till USOC om en blodtransfusionsincident som involverade USA cyklister som han sa att han bevittnade under OS.

Lea inrättade snabbt en undersökningsspanel på tre personer för att undersöka händelsen.

Undersökningen och dess följder

En utredning om den blodtransfusionerna presenterades vid US Olympic Training Center i Colorado Springs redan den 17 november 1984. USCF:s verkställande direktör Dave Prouty begärde att han skulle inkluderas i utredningspanelen.

Dr Tom Dicksons rapporterade om vilka idrottare han sett få transfusioner och vilka andra han hört talas om. Han nämnde inte att han deltog i något av detta, men det framgick senare att han tydligen hade hjälpt till med några av transfusionerna. Utfrågningen fortsatte sedan med tränarna Eddie Burk, Carl Leusencamp och Tim Kelly tillsammans med vicepresident Mike Fraysse. Några beslut togs uppenbarligen inte efter utfrågningarna

Representanter för USA:s olympiska kommitté försökte skriva om historien för att avleda uppmärksamheten från deras egna misslyckade ansvar att fastställa en policy mot transfusioner. I en artikel som publicerades den 12 januari citerades läkaren Irving Dardik, ordförande för USA:s olympiska kommittés Sports Medicine Council, för att säga att “USOC har informellt förbjudit det kontroversiella förfarandet” (det vill säga blodtransfusio-nerna). Faktum är att förbudet dock var så informellt att det inte förekom i någon av deras förordningar eller vägledande dokumentation. Med andra ord, byråkraterna försökte slippa sin del av ansvaret.

Huvudartikeln i Sports Illustrated-upplagan av 21 januari 1985 hade en ganska noggrann och omfattande genomgång av händelsen.

USCF:s styrelse bestraffade arrangörerna av blodopingsprojektet och vidtog åtgärder för att förhindra en upprepning när styrelsen sammanträdde den 18 januari 1985. Inget straff av de idrottare som var involverade i bloddopingen övervägdes vid något tillfälle eftersom de inte hade brutit mot några regler och för det mesta hade följt tränarnas och andra funktionärers vägledning. Det förekom falska rykten om att cyklisterna skulle straffas och att de olympiska medaljer som de vunnit skulle behöva lämnas tillbaka.

Efter en genomgång av transfusionsincidenten beslutade styrelsen om disciplinära åtgärder för tränare Eddie B. och Dr Ed Burke enligt följande:

Brev om reprimand

30 dagars avstängning utan lön med omedelbar verkan

Sex månaders försening i löneöversyn

Vicepresident Mike Fraysse fick mildare straff eftersom det inte var mycket som kunde göras mot honom av styrelsen:

Brev om reprimand

Avsättning som ordförande i tävlingskommittén

Degradering från förste vicepresident till tredje vicepresident

Begär att han avgår som vice ordförande

Genom att anta regler mot bloddoping blev USCF uppenbarligen den första idrotts-organisationen i världen att förbjuda denna praxis. Andra förbund antog senare liknande förbud, inklusive USA:s olympiska kommitté, Internationella cykelförbundet och Internationella olympiska kommittén.

Eero Mäntyranta med genmutationen

Eero Antero Mäntyranta (född 20 november 1937 i Pello, död 29 december 2013 i Uleåborg) är en av de mest framgångsrika finska längdskidåkarna genom tiderna. Som barn åkte alla i Pello i Finska Lappland skridskor och skidor, men Mantyranta utmärkte sig. För honom var längdskidåkning ett nästan året runt transportsätt, inte bara en vintersport på fritiden. Den enda direkta vägen till hans grundskola gick över en sjö och resan, som genomfördes i mörker under vintermånaderna, kunde ta en timme. Han vann sitt första längdskidlopp vid 7 års ålder och dominerade sedan alla tävlingar i början av tonåren. Så småningom kunde han få anställning som gränsvakt, som tog sig runt i sitt revir på skidor. Som tjugoåring ingick han i det olympiska laget som reste till Squaw Valley, Kalifornien för vinterspelen 1960, och tog en guldmedalj i 4x10 km längdskidåkning. Han dominerade sedan sporten och tävlade i fyra olympiska spelen mellan 1960 och 1972 och vann 7 medaljer totalt. Men det var inte bara att han vann, det var sättet han gjorde. I sin bästa ålder 1964 vann han 15 km-tävlingen med 40,7 sekunder, en segermarginal som ingen vinnare har åstadkommit sedan dess. Trots sin idrottsframgångar såg Eero inte fysiskt imponerande ut.

Mäntyranta tävlade i fyra vinter-OS (1960-1972) och vann sju medaljer vid tre av dem. Hans framträdande vid vinter-OS 1964 gav honom smeknamnet “Mister Seefeld”, vilket syftar på platsen där längdskidåkning och skidskytte tävlingar ägde rum – han var en av Sixten Jernbergs viktigaste konkurrenter. Det finska utbildningsministeriet gav Mäntyranta Pro Urheilu-priset som erkännande år 2000. Det finns också ett museum centrerat på Mäntyranta i hans födelseort Pello.

Ur dopingmedicinsk synvinkel är han en av de mest intressanta personerna i dopinghistorien – på grund av en idrottspositiv genmutation som finska forskare påvisade två decennier efter att han slutat elitidrotta – även om han endast blev dopingpåkommen för ett (på den tiden) ett ”banalt” intag av amfetamin.

Mäntyranta hade primär familjär och medfödd polycytemi (PFCP) som orsakade en ökning av röda blodkroppar och hemoglobin på grund av en mutation i genen för erytropoiein-receptorn (EPOR). Mutationen identifierades efter en DNA-studie som fann förändringen hos en hög andel medlemmar av hans släktingar, vilket rapporterades 1993. Det är därför knappast förvånande att rykten om bloddopning florerade. Inte ens hans insisterande på att han hade haft så höga nivåer mätt så långt tillbaka som tonåren verkade inte övertyga många. Men när flera andra medlemmar av Mäntyrantas familj visade sig ha höga andelar röda blodkroppar i sin cirkulation, började hans familj uppmärksamma Finlands hematologer och genetiker. En genetiker i synnerhet, Albert de la Chapelle identifierade generna som ligger bakom många familjebaserade tillstånd med hjälp av länkkartläggningstekniken Han började samla in DNA från så många av familjemedlemmarna som han kunde. Han upptäckte Eero Mäntyranta inte var den enda med mutationen. Han ärvde den från en av sina föräldrar och gav den vidare till några av sina barn. Han hade farbröder, kusiner, syskonbarn som också hade mutationen – varje enskild familjemedlem som hade ökade nivåer av röda blodkroppar hade denna mutation av EPOR. De la Chapelle utvärderade så småningom 97 medlemmar av familjen Mäntyranta i 5 generationer, av vilka 29 drabbades av tillståndet. Många familjemedlemmar visste inte ens att de var drabbade.

Den förhöjda hematokrithalten som ökar blodets förmåga att transportera syre; EPOR-mutationen spekuleras i att ha bidragit till Mäntyrantas anmärkningsvärda uthållighet. Det har har dessutom rapporterats att några av Mäntyrantas släktingar har varit i elitklass. Det kan nämnas Pertti Teurajärvi, Mäntyrantas brorson, dubbel OS-medaljör i längdskidåkning och Eeros systerdotter som var nationell mästare i skidåkning.

Eero Mäntyranta hade faktiskt mycket låg erytropoietinhalt (normala värden är mellan 8 och 43 och Mäntyrantas var 8,6), men sekvensen av Mäntyrantas EPOR-gen var unik. Erytropoietin är en molekyl som, när den utsöndras av njurarna, stimulerar skapandet av nya röda blodkroppar. Njurarna utsöndrar erytropietin som svar på låga syrenivåer, som på höga höjder där luften är tunn. Uthållighetsidrottare (särskilt skidåkare) kommer ofta att träna på hög höjd, vilket målmedvetet inducerar en miljö med låg syrehalt, vilket gör att deras kroppar naturligt kan producera extra röda blodkroppar. Faktum är att erytropoietin har använts som dopningsmedel av idrottare, vilket dock förbjudits sedan början av 1990-talet och tillämpats sedan de olympiska spelen 2000.

Erytropoietin agerar inte ensam. När hormonet väl utsöndras av njurarna måste det kommunicera med celler i benmärgen vilket sker via EPOR. Signalen att producera fler röda blodkroppar sker när erytropoietin binder till EPOR. Utan EPOR spelar det ingen roll hur mycket erytropoietin man har, signalen kommer ändå aldrig att komma till uttryck. Omvänt, om EPOR alltid är bundet till erytropoietin, skickas signalen utan avbrott. Eero Mäntyranta hade en unik och mycket sällsynt variant i sin EPOR-gen som gjorde att det verkade som att EPO var bunden till den och överförde signalen. Hans EPOR var “alltid på”, vilket innebar att han naturligt producerade ett stort antal röda blodkroppar. I prov av hans extraherade benmärg fann man att den var hyperaktiv när det gäller att producera röda blodkroppar. I själva verket var hans benmärg emellertid aktiv även utan det vanliga behovet av erytropoietin. Det visade sig att Mäntyrantas benmärg var utsökt känslig för erytropoietin på grund av hans annorlunda erytropoietinreceptor

Resultatet av denna unika variant var en speciell blodbild. Hans hematokrit var så hög som 60-65 (normala nivåer är runt 40-45). Hans hemoglobin var över 200 g/L i hela hans liv, medan det typiska manliga intervallet är 140-170 g/L

Även om högt antal röda blodkroppar har hälsorisker, är den största fördelen att det ökar blodets syrekapacitet. Mer syre innebär att musklerna tröttnar i en långsammare takt, vilket leder till bättre atletisk prestation. Dessa fördelar, och hans hängivenhet att träna, hjälpte honom troligen att nå elituthållighetsstatus.

Mäntyranta erbjuder ett intressant och tydligt exempel på en roll för genetik för idrotts-prestationen, men han är verkligen speciell i detta avseende. Det betyder dock inte att varianter med mindre effekt inte är viktiga – tvärtom! Många varianter av liten effekt kommer sannolikt att ge idrottare ett försprång. De kan göra dem lite uthålligare, lite starkare eller lite snabbare och tillsammans med väl avvägd träning ge bättre resultat. Geneffekten ger emellertid också en särskild förståelse för att det räcker inte med en viktig mutation, psykologi, sociologi och andra yttre faktorer kommer att bli avgörande för om personen men mutationen kommer att bli elitidrottsman eller inte.

1972 testade Mäntyranta positivt för amfetamin vid en finsk tävling, och blev den första av sina landsmän som är kända för att ha blivit ertappad för dopning. Han erkände senare också att han tagit tillväxthormon, som då ännu inte var förbjudna.

Den första som fälldes för bloddoping: Eirini Kokkinariou

Eirini Kokkinariou (född 14 februari 1981 i Aten, Grekland ) var en kvinnlig grekisk lång-distanslöpare. Hon tävlar mest i 3000 meter hinderlopp. Hon slutade nionde vid världscupen 2006 och tog tredjeplatsen vid 2007 års Superleague. Hon tävlade vid 2006 års EM, världsmästerskapen 2007, OS 2008 och världsmästerskapen 2009 men utan att nå finalen.

2012 stängdes hon av från sporten i fyra år efter avvikelser i sitt blodpass talande för doping.

Kokkinarious blodprofil var “avgörande bevis på upprepad användning av bloddopning under en utdragen tidsperiod såväl som hennes engagemang i ett noggrant planerat dopningssystem.” Hon var den första idrottaren som anklagades för dopning av IAAF baserat på blodpasset, och hade för det till en början blivit avstängd i två år av det grekiska friidrottsförbundet (SEGAS). IAAF överklagade till CAS för att öka det tvååriga förbudet baserat på Kokkinarious onormala blodprofil från 2009 till 2011. Avstängningen fördubblades till fyra år efter att CAS bifallit överklagandet eftersom det fanns försvårande omständigheter som förtjänade en utökad avstängning.

Testning för rekombinerat erythropoietin (rhEPO) introducerades vid OS i Sidney år 2000 och omfattar inte bara erytopoietin utan alla erytropoes (blodkroppsbildande)-stimulerande substanser (ESAs) – i princip analoger till erytropoietin. Initialt användes ett kombinerat blod- och urintest där man av blodprovet fick en indikation om att det förelåg doping varefter urinprovet verifierade substansen i urinen.

2005 – som ett svar på ”WADAs EPO-rapport” – startade det systematiska uppbyggandet av blodpass, Athlete Biological Passport, ABP), som genom longitudinella hematologiska profiler som bearbetades statistiskt på ett säkrare sätt kunde avgöra om bloddoping förekommit genom enbart blodprov.

2009 var de teoretiska och praktiska delarna av ABP helt på plats och den hematolgiska modulen sågs som en väsentlig del av antidopingarbetet och övervakningen automatiserades genom att provsvaren sändes in direkt till the Anti-Doping Administration and Managements System (ADAMS). Det behövs således inte någon ytterligare provtagning för att tolka resultaten av ABP-analyserna, men en expertkommitté gör en slutlig avvägning av styrkan i dopingmisstanken (dessa bedömningar görs utan att expertkommitténs medlemmar vet vems blodpass de studerar) innan det lämnas en rekommendation att fri, fälla eller testa vidare.

Eirini Kokkinariou lämnade blodprov för blodpass fyra gånger mellan 2006 och 2009 och proven analyserades enligt den standard som var given. På grund av sina fina idrottsresultat blev Kokkinariou uttagen till the Registered Testing Pool i mitten av 2009, vilket innebär att hon inkluderades i IAAFs ABP-program. Mellan juli 2006 och augusti 2011 togs det blod till blodpasset nio gånger, och dessutom använde IAAF de fyra tidigare blodprovssvaren i sina beräkningar.

Den 23 augusti 2011 startade IAAF en undersökning baserat på ABP-analyserna, där statistiken talade för att det rörde sig om bloddoping med minst 99 procents sannolikhet, vilket stöddes av en expertgrupps utlåtande. Eirini Kokkinariou förklarade fynden med extrem trötthet, sjukdom, användande av hypoxiskt tält, höghöjdsträning och möjligen felaktiga blodprovstagningar. Förklaringarna förkastades enhälligt av expertgruppen.

En muntlig förhandling med den grekiska antidopingorganisationskommitténs disciplimnämnd hölls den 15 december. Efter den beslöt disciplinnämnden att idrottaren skulle stängas av i två år den 24 januari 2012.

Den 2 maj 2012 överklagade IAAF beslutet till CAS (CAS 2012/A/2773). Samtidigt hade Kokkinariou överklagat beslutet i civilrättslig grekisk domstol, ASEAD (the National Supreme Sports Court). Hon meddelade samtidigt att hon inte hade råd att medverka i någon CAS-handläggning, en bedömning till vilket också den grekiska antidopingorganisationen anslöt sig. Fallet fick således avgöras av CAS utan hörande av de som avkunnat den första domen och enbart på basen av dokument.

IAAF hävdade att det förekommit någon form av bloddoping åtminstone i maj-juni 2009 (före blodpassprov 1, 2 och 3) och i maj-juni 2011 (före prov 8). Avseende hela perioden 2006-2009 ansåg IAAF att det var troligt att Kokkinariou upprepat (årligen) hade använt någon erytropoietinanalog medan blodtransfusion inte var uteslutet som tillägg. Sammantaget hade 6 av de 9 tillgängliga ingående delarna av löparens ABP kvoter över 1,0, vilket starkt indikerar bloddoping. Mycket höga och varierande hemoglobinvärden tillsammans med mycket låga retikulocytvärden påvisades. De höga ferritinvärdena (upp till 1454 ng/mL när referensvärdet ligger på 6-159 ng/mL) talade också för bloddoping liksom att de varierade mycket. Detta kan beror på att löparen fått injicerat stora mängder järn, vilket är det man rekommenderar vid samtidig användning av erytropoietin för att få full effekt – den enda andra riktigt rimliga förklaringen är sjukdomen hemochromatosis enligt de medicinska experter som WADA tillkallat. Alla tre experter som konsulterades såg de höga ferritinvärdena som starka indicier för bloddoping.

I slutpläderingen hävdar skiljedomaren att det fanns två försvårande faktorer vid utdömande av avstängningen:

Bloddopingen gjordes enligt en fastlagd plan (“consistently presents abnormal values in the summer period (June to mid-August) and normal values between end of August and May”)

Det vidtogs särskilda åtgärder för att dölja dopingen (“the doping was timed to avoid positive testing in conventional doping tests during events”.

The Court of Arbitration for Sport fastställde 30 November 2012:

Irini Kokkinariou är skyldig till bloddoping

Det finns aggraverande omständigheter

Avstängningen blir 4 år (en dubblering jämfört lägre instansers avstängningar)

Alla idrottsresultat, segerpremier etc från och med 2 juli 2009 är förverkade

Av visst intresse är att Kokkinariou fälldes mot bakgrund av blodprovsresultat från tiden före införandet av biologiska pass för idrottare 2009 (databasresultat så långt tillbaka som 2006 ansågs ge indikationer på blodmanipulation). IAAF angav dock att de bara hade använt uppgifter från före 2009 som “bekräftande bevis” på hennes dopning.

Charly Wegelius med mjältskadan

Charles “Charly” Wegelius (född 26 april 1978 i Esbo, Finland) är en brittisk före detta professionell cyklist. Han lyckades aldrig vinna ett professionellt lopp individuellt, men gjorde ändå karriär genom att vara en pålitlig och stark cyklist, framför allt i bergen.

Wegelius började sin karriär i Frankrike och körde för Vendée U. Hans bästa resultat var att vinna U23-sektionen i Grand Prix des Nations, varefter Le Télégramme rapporterade att Wegelius var en av de mest lovande ryttarna i sin generation. [1]

Wegelius cykelambitioner fick ett tidigt bakslag, efter att ha skadats i en olycka med ett terrängfordon, vilket resulterade i att hans mjälte togs bort och beskedet att han aldrig skulle cykla igen. Han återhämtade sig trots det och fick kontrakt med Linda McCartney Racing Team. Teamet startades av 1998 av Beatles-medlemmen Paul McCartneys fru Linda McCartney som i sitt företag Linda McCartney Foods tillverkade vegetarisk mat och sponsrade vegetariska cyklister och personal. Förhoppningen var att teamets framgång skulle främja vegetarianism och Linda McCartney Foods. Det var det första brittiska laget som ställde upp i Giro d’Italia men kostnadsökningen men när laget och dess åtaganden växte men Linda McCartney Foods inte fortsatte att sponsra upplöstes laget 2001 med rapporterade skulder på mer än 1 miljon USD och en tvist med Internationella Cykelunionen om förarnas löner. 2012 inleddes en brittisk utredning av det tidigare laget, med anklagelser om att ledningen inte organiserade dopning, men visste att flera cyklister använde prestationshöjande droger och blundade.

Wegelius tävlade i Italien för en rad lag mellan 2000 och 2009.

I oktober 2002, då Wegelius var rankad 857a i världen, uteslöts han efter ett blodprov under Tour of Lombardy då han före loppet visades ha en hematokritnivå som låg över den tillåtna tröskeln på 50 procent. Ett efterföljande urinprov var negativt för erytropoietin.

Mjälten är en del av retikuloendoteliala systemet som tar hand om främmande partiklar som bakterier och parasiter samt restprodukter. I den röda pulpans trånga nätverk fastnar åldrade och defekta röda blodkroppar och bryts sedan ner av makrofagerna. Enligt den vetenskapliga litteraturen kan splenektomi ge upphov både till en måttlig polycytemi och till anemi.

Wegelius var också inblandad i kontroverser 2005 vid VM i Madrid när han och lagkamraten Tom Southam valde att inte åka för att skydda Roger Hammond, deras ledande team-medlem i ett engelskt lag, i världsmästerskapet på landsväg, och istället tog instruktioner från det italienska laget – ett italienskt lag fullt av personliga vänner – mot 2500 Euro. Wegelius återbetalade senare kostnaderna i samband med hans deltagande i evenemanget och valdes aldrig ut att representera sitt landslag igen.

ETISKA ASPEKTER

Tidiga uttalanden om etiskt förkastande av bloddoping

Redan 1987 publicerade American College of Sports Medicines sin ståndpunkt ”att användningen av bloddopning som ett ergogent hjälpmedel i idrott är oetiskt och oförsvarligt [No authors listed. American College of Sports Medicine position stand on blood doping as an ergogenic aid. Med Sci Sports Exerc 1987; 19: 540-3].

1996 förtydligade detta ytterligare genom ett nytt deklarerade av American College of Sports Medicine: ”Alla sätta att bloddopa som ett försöka att öka en idrottsutövares prestationsförmåga är oetiskt, orättvist och utsätter idrottare för oberättigade och potentillt allvarliga hälsorisker [Referens: Sawka MN, Joyner MJ, Miles DS, Robertson RJ, Spriet LL, Young AJ. American College of Sports Medicine position stand. The use of blood doping as an ergogenic aid. Med Sci Sports Exerc 1996; 28: i-viii].

Abortdoping

Benämningen ”abortdopning” hänvisar till det teoretiska – men svårbevisade – bruket att medvetet framkalla graviditet specifikt för idrottsprestationshöjande fördelar och sedan avbryta graviditeten. Rykten och anklagelser om sådan förfarande började under internationella sportevenemang i mitten av nittonhundratalet, och ett antal läkare och forskare har upprepade påståenden om det, men det är fortfarande obevisat och bör i första hand betraktas som en myt, som kan ha realiserats i anekdotiska fall.

Även om kvinnliga idrottare naturligtvis kan bli gravida under sin karriär och omedelbart före stora idrottsevenemang, och även om många idrottare har rapporterat ökad prestation under graviditeten, syftar ”abortdopning” specifikt på avsiktlig graviditet med det uttryckliga syftet att öka prestationen. Stigmat och föreställningar kring abortdopning har visat sig ha en skadlig effekt på kvinnliga idrottare som blir gravida under en aktiv karriär. Skiljelinjerna mellan abortdoping och ”normalt” idrottande under graviditet kan gå mellan att graviditeten avslutas med framkallade abort efter de stora tävlingarna respektive vid upprepade graviditeter som kommer ”lägligt” i förhållande stortävlingar.

Fysiologi

Hormonella och andra förändringar i graviditeten påverkar den fysiska prestationen. Under de första tre månaderna av graviditeten är det känt att en kvinnas kropp producerar ett visst överskott av röda blodkroppar, det vill säga syrebärande hemoglobin, för att stödja det växande fostret. Andra potentiella fördelar erhålls från ökningen av hormoner som graviditeten inducerar, främst progesteron och östrogen, men även testosteron. Ökning av hormoner som relaxin, som gör ledbanden kring bäckenet mer elastiska för att förbereda sig för förlossningen (men som också kan ge betydande rörelseutlöst smärta), kan i vissa idrottsgrenar också ha en prestationshöjande effekt på ledernas rörlighet. Å andra sidan kan fördelarna med graviditetsförändringarna oftast mer än väl uppvägas av nackdelarna med illamående och trötthet, vilket är vanliga fenomen under tidig graviditet. Under senare delen av graviditeten är dessutom vanligen livmoderns storlek ett hinder för kvinnan från att kunna tävla i de flesta idrottsgrenar.

Det är inte bara blodvolymen som ökar, utan blodet omfördelas också. Mer blod pumpas från hjärtat till livmodern. Dessutom ökar vilopulsen, leder och ligament uppluckras och blir instabilare, kvinnan får en annan kroppsställning och belastning; allt för att kroppen anpassar sig inför förlossningen.

Testosteronet i kroppen ökar lite, men det kompenseras av en ökning av äggviteämnet som binder testosteronet. Det biologiskt verksamma testosteronet ökar således inte.

Det är inte bara medan graviditeten pågår som det hävdats att elitidrottarens prestations-förmåga höjs. Världsstjärnor som Jelena Välbe, Marja-Liisa Kirvesniemi, Berit Aunli, Ingrid Kristiansen, Irina Privalova med flera har hållits fram som bevis för att kvinnliga idrottare blir bättre efter att de fött barn. Fysiologiskt finns det ingenting som bekräftar den tesen.

Kunniga läkare uppmanar gravida kvinnor att fortsätta träna så länge kroppen medger det, men den gravida skall undvika idrotter som kan ge fall eller slag mot kroppen och dessutom försiktighet med idrotter som kan ge ett alltför stort stresspåslag.

Efter att barnet är fött tar det cirka sex veckor för de hormonella förändringarna att gå tillbaka, exempelvis för ligament och leder att åter stabilisera sig samt för livmodern och bäckenbotten att stärkas. Under den tiden är det inte rekommendabelt för medelmotionären att hoppa och skutta alltför friskt.

Försämrad prestationsförmåga?

I en studie från 1984 gjord på löpare, dansare och längdskidåkare visade det sig 60 procent av de undersökta fick nedsatt prestationsförmåga under graviditetens första del. I en annan studie tre år senare, gjord av samma forskare på 22 löpare, framkom att deras fysiska prestationsförmåga minskade med i genomsnitt 10 procent under graviditetens första fyra veckor och med 25 procent under de nästkommande fyra veckorna. Orsakerna till att prestationsförmågan minskade var i båda studierna vanliga graviditetseffekter såsom trötthet och illamående. Graviditetseffekterna är dock högst individuella. Därför är det en vansklig metod att rekommendera för att höja prestationen, eftersom man inte vet hur man kommer att må, om man blir sämre, något bättre eller oförändrad i prestationshänseende,

I långdistanslöpning och liknande uthållighetsidrotter är det också andra faktorer som spelar in. Riskerna för fostret uppstår främst av den förhöjda kroppstemperaturen. När kvinnan dessutom drabbas av uttorkning till följd av kraftig svettning utsätts fostret för ytterligare påfrestningar.

Ryktesspridning

Västerländska medier började emellertid anklaga östeuropeiska länder för abortdopning redan under de olympiska sommarspelen 1956, och anklagelserna återkom vid de olympiska sommarspelen 1964. Rykten om abortdopning fortsatte under hela 1970- och 1980-talen, främst riktade mot östtyska idrottare.

Många elitidrottare i konditionsidrotter har förts fram som belägg för att graviditet skulle vara enbart postivit för prestationen och att de positiva effekterna under den tidiga delen av graviditeten skulle ha använts som doping i det forna Sovjetunionen och andra öststater. De kvinnliga elitutövarna påstods ha blivit gravida för att sedan abortera fostret.

År 1988 stödde prins Alexandre de Merode, då vicepresident för Internationella Olympiska Kommittén (IOC), rapporter om att östeuropeiska idrottare blev artificiellt inseminerade och sedan avbröt två till tre månader senare i ett försök att öka idrottsprestationer. Merode sa att han kände en schweizisk läkare som utförde proceduren. Dr Robert Voy från USA:s olympiska kommitté avfärdade dock påståenden som en “löjlig myt.”

1988 uttalade sig den finska läkaren Risto Erkola till Sunday Mirror “Abortdoping är hemsk och omoralisk. Nu när dopingtester är rutin, blir graviditet favoritsättet att få ett försprång före konkurrenterna.” Den andra meningen i Erkolas kommentar citeras ofta i diskussioner, rapporter och artiklar om abortdopning. Enligt faktagranskningswebbplatsen Snopes.com var medierapporter som följde detta påstående skeptiska till uttalandet, inte minst eftersom “det är inte klart om Erkola skulle ha haft någon förstahandskännedom om sovjetiska dopningsmetoder.” Under samma tidsperiod sas i Sunday Mirror professor Renate Hoch från Genève, som sysslar med artificiell insemination, att “problemet har blivit så utbrett nu att vi gjorde en regel att aldrig hjälpa en kvinnlig idrottare om hon bara vill bli gravid för att helt enkelt att vinna ett lopp.”

I Textbook in Physiology and Patophysiology (1999) skrev Dr. Paul-Erik Paulev, en dansk professor i fysiologi vid Köpenhamns universitet, att “i vissa länder har kvinnliga idrottare varit gravida i 2-3 månader, för att förbättra deras prestation bara efter en abort.” Dr Paulevs kommentar citeras också ofta i diskussioner om abortdopning. Hans kommentarer gjordes först i ett självpublicerat dokument som inte innehåller några referenser för dess påståenden om abortdopning.

1994 gav en person som påstod sig vara Olga Karasyova, som vann en guldmedalj i gymnastik vid olympiska sommarspelen 1968, en intervju med den tyska TV-stationen RTL Television, där hon sa att abortdopning var utbredd bland sovjetiska idrottare på 1970-talet, och att tjejer så unga som 14 år tvingades ha sex med sina tränare. När han kontaktades av olika tidningar för kommentarer, sa Karasyova att personen som hade gett intervjuerna var en bedragare och 1997 stämde Karasyova framgångsrikt den ryska tidningen “AIDS-Info” för förtal efter att de publicerat referenser till 1994 års historia.

Från och med 2002 kategoriserar Snopes.com abortdopning som “obevisad”, och drar slutsatsen att “abortdopningspåståenden, specifikt har sina rötter i rykten från kalla krigets era, bekräftas endast av ett enda tvivelaktigt fall, stöds av spekulativ vetenskap och är till stor del förstärkt under senare år av anti-abortgrupper.” Snopes anklagar anti-abortgrupper för selektiv rapportering och att använda dåliga argument när de skriver artiklar om ämnet. Feministen Germaine Greer skrev 2007 att “det inte finns några verkliga bevis” för att abortdopning någonsin har gjorts, och den brittiska hälsojournalisten Peta Bea fann 2009 att “bevis för att det inträffade har aldrig styrkts.”

Det har inte framkommit misstankar om abortdoping i Sverige.

Regler och moral

Graviditetsdoping anses inte vara något brott mot idrotten regelverk enligt av IOC. Prins Alexandre de Merode uttryckte det som att organisationen inte anser att den skall “övervaka moderskap polisiärt.” Abortdopning finns inte och har aldrig funnits på WADA:s lista över förbjudna ämnen eller metoder.

Däremot finns det med all sannolikhet en stor majoritet för att allmänheten upplever abortdoping som moraliskt mycket klandervärt, men det kan man inte fällas i domstol för.